微小RNA-7-5p調(diào)控三葉因子3對宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

邵曉雯， 秦錦龍， 宋力雯， 高丹鳳， 劉瓊花， 成佳景

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072; 2. 江蘇大學(xué)附屬澳洋醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 張家港 215600)

宮頸癌是全球常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占女性惡性腫瘤的第二位，死亡率占第三位[1]。目前對高危人群的人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)篩查的普及使宮頸癌的發(fā)病率呈下降趨勢[2]，但近20年，我國宮頸癌發(fā)病率和死亡率仍呈現(xiàn)上升趨勢，探索宮頸癌關(guān)鍵發(fā)病機制可為其早期發(fā)現(xiàn)和早期干預(yù)提供重要靶點。

微小RNAs(miRNAs)是一類分布廣泛的小的非編碼蛋白質(zhì)的RNAs，由21～25個核苷酸組成。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)顯示，每個miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)百個靶基因，影響多條信號通路，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)功能[3]。

三葉因子3(trefoil factor 3, TFF3)屬于腸三葉因子家族的成員，基因定位于染色體21q22.3上，編碼的蛋白相對分子質(zhì)量約為7000或14000(二聚體)[4-5]。已有研究發(fā)現(xiàn)TFF3能通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3α(signal transducers and activators of transcription 3α, STAT3α)和STAT3β亞基磷酸化而激活STAT3信號通路，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過程[6]，通過激活核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)和Twist信號通路抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞的遷移[7-8]。在胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤中表達(dá)均異常升高。有研究表明miR-7-5p/TFF3信號通路在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、遷移功能中發(fā)揮重要作用，且該信號通路與炎癥性疾病有關(guān)[9-10]。

本研究通過探討miR-7-5p靶向調(diào)控TFF3的表達(dá)，進(jìn)一步明確miR-7-5p/TFF3與宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移的關(guān)系，從細(xì)胞水平闡明miR-7-5p/TFF3對宮頸癌發(fā)生發(fā)展的意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

30例宮頸癌腫瘤組織和癌旁正常組織取自2013—2015年在同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的宮頸癌患者，研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(編號： SHSY-IEC-4.0/19-45101)。人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa、C-33 A和HeLa 299購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清、細(xì)胞用青霉素和鏈霉素購自美國Gibco公司；CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所；總RNA分離提取試劑TRIzol和小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、鼠抗人β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠及抗兔二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司。熒光素酶報告系統(tǒng)質(zhì)粒購自美國Promega公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Transwell小室購自美國Corning公司；靶向TFF3的siRNA和1條陰性對照siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，序列見表1；miR-7-5p mimics和1條陰性對照microRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，序列見表2。

表1 小干擾RNA序列

NC siRNA: 陰性對照siRNA

表2 微小RNA序列

NC microRNA: 陰性對照microRNA

1.2 研究方法

1.2.1 宮頸癌組織標(biāo)本TFF3表達(dá)水平的檢測 所有標(biāo)本于液氮中保存。TRIzol裂解組織標(biāo)本，抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。取稀釋10倍后cDNA樣本為模板，β-actin為內(nèi)參，按照實時熒光定量PCR檢測試劑盒說明書提供的方法在ABI 7900實時熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR所需引物見表3。PCR反應(yīng)條件: 第1步，預(yù)變性95℃ 30s；第2步，95℃ 5s、60℃ 30s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相對表達(dá)水平。

表3 聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa貼壁生長于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。按轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000說明書提供的方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1d，將處于對數(shù)生長期的HeLa、SiHa細(xì)胞以(2～2.5)×105個/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞用配制好的完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；次日，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)30%～50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染設(shè)計為2組: 處理組(TFF3-siRNA或miR-7-5p mimits)、陰性對照組(NC-siRNA或NC-miR)。將上述TFF3-siRNA、miR-7-5p mimics、NC-siRNA或者NC-miR轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa 6h后，更換新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8法檢測宮頸癌細(xì)胞株HeLa和SiHa的增殖活性 收集轉(zhuǎn)染7h后的細(xì)胞，分別繼續(xù)培養(yǎng)1d，以3000個/孔的密度分別接種于96孔板中，細(xì)胞懸液為100μL/孔，每組設(shè)5個復(fù)孔；細(xì)胞分別繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4和5d后，加入10μL/孔CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1h，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在波長450nm處檢測各孔的光密度值(D450)，光度大小與細(xì)胞增殖活性成正比。

1.2.4 克隆形成實驗檢測宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa克隆形成能力 收集轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞，按1500個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，每組設(shè)3個平行樣品，靜置培養(yǎng)10d，直到6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)。采用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，風(fēng)干后，用0.1%結(jié)晶紫染色，觀察并計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，結(jié)果取平均值。

1.2.5 Transwell遷移實驗檢測宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa遷移能力變化 轉(zhuǎn)染7h后消化細(xì)胞，以含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，5×104個/小室接種于Transwell上室中，補足培養(yǎng)液至100μL，下室為500μL完全培養(yǎng)液，24h后取出，將上室內(nèi)面擦凈，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，清洗，拍照，對穿過小室的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計數(shù)，穿過小室的細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞遷移能力正相關(guān)。

1.2.6 Western印跡法檢測宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa中TFF3蛋白水平的變化 在宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa中轉(zhuǎn)染上述siRNA或mimics，48h后抽提蛋白，用Western印跡法檢測TFF3蛋白水平的變化。RIPA裂解2×106個細(xì)胞總蛋白進(jìn)行蛋白定量,每孔上樣50μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗兔抗人TFF3，一抗鼠抗人β-actin(1∶1000)4℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶2000)室溫孵育1h，經(jīng)ECL發(fā)光液反應(yīng)后，暗室曝光，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行比較。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 為分析miR-7-5p是否可以在體外與TFF3 3′UTR相互結(jié)合作用，本實驗采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-7-5p靶向結(jié)合TFF3 3′ UTR情況。將野生型TFF3 3′ UTR和突變型TFF3 3′ UTR克隆至pGL3-Promoter質(zhì)粒螢火蟲熒光素酶下游，將待測細(xì)胞鋪于12孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時，共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和microRNA，并將海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染48h后，按照Promega雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒說明書進(jìn)行熒光素酶活性檢測，活性強度與miR-7-5p抑制作用呈反向關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TFF3在宮頸癌組織及人宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞系中高表達(dá)

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示TFF3在73.33%(22/30)的宮頸癌組織中較其癌旁組織高表達(dá)，其mRNA水平在宮頸癌組織和癌旁組織之間有顯著差異(P<0.001)。在宮頸癌細(xì)胞系C-33 A、HeLa 299、HeLa、SiHa中均有表達(dá)，其中在HeLa和SiHa中表達(dá)較高，見圖1。

圖1 TFF3在宮頸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況Fig.1 TFF3 expression of TFF3 mRNA in cervical cancer tissues and cell lines

2.2 實時熒光定量PCR及Western印跡法檢測TFF-siRNA在宮頸癌細(xì)胞中的干擾效率

siRNA轉(zhuǎn)染24h后，與陰性對照組比較，TFF3-siRNA組的HeLa和SiHa細(xì)胞中TFF3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=37.34、17.33，均P<0.01)，見圖2。

圖2 TFF3-siRNA在宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中的干擾效率鑒定Fig.2 Knock down efficiency of TFF3-siRNA in HeLa and SiHa cells**P<0.01

2.3 敲減TFF3基因的表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及克隆形成能力的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株HeLa和SiHa后1、2d，各組細(xì)胞的增殖能力無明顯差異；在siRNA轉(zhuǎn)染后3、4和5d時，TFF3-siRNA組細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3A。

Transwell檢測結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株HeLa和SiHa 24h，結(jié)晶紫染色后，顯微鏡(×100)下進(jìn)行拍照并計數(shù)，TFF3-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)較陰性對照組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.78、13.124，均P<0.05)，見圖3B。

細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，siRNA干擾10d，計數(shù)6孔板中陰性對照組和TFF3-siRNA組的克隆形成數(shù)，結(jié)果顯示，TFF3-siRNA組細(xì)胞集落形成能力明顯弱于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.213，P<0.05；t=13.635，P<0.05)，見圖3C。

圖3 敲減TFF3抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和克隆能力Fig.3 Knockdown of TFF3 inhibits proliferation, invasion and colony formation capacity of cervical cancer cells**P<0.01

2.4 miR-7-5p靶向結(jié)合TFF3 3′UTR抑制TFF3的表達(dá)

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)手段，結(jié)合TargetScan(http://www.targetsca.org)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)等數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-7-5p是一個潛在的microRNA可靶向結(jié)合TFF3 3′UTR。并利用雙熒光素酶報告實驗進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示miR-7-5p直接調(diào)控TFF3的表達(dá)。采用Western印跡法進(jìn)一步對TFF3蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-7-5p mimics之后，TFF3的蛋白表達(dá)明顯降低。實驗結(jié)果表明，miR-7-5p通過與TFF3基因3′UTR位點結(jié)合從而抑制其表達(dá)。見圖4。

圖4 miR-7-5p靶向調(diào)控TFF3 抑制其在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 miR-7-5p is a direct regulator of TFF3 in cervical cancer cellsA： TFF3 3′UTR的熒光素酶報告載體構(gòu)建；B： 在宮頸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-7-5p后TFF3蛋白表達(dá)水平；C: 在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染熒光素報告載體或miR-7-5p后，熒光酶活性變化；**P<0.01

2.5 過表達(dá)miR-7-5p對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及克隆形成能力的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞株HeLa和SiHa過表達(dá)miR-7-5p后，經(jīng)過4d和5d的培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染miR-7-5p mimics組細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5A。

Transwell檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-7-5p使宮頸癌細(xì)胞株HeLa和SiHa遷移能力明顯下降，轉(zhuǎn)染后24h，在顯微鏡(100×)下計數(shù)，miR-7-5p mimics轉(zhuǎn)染組(165±15、100±208)的細(xì)胞穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)較陰性對照組(364±48、411±27)少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.610、10.124，均P<0.05)。見圖5B。

細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞株HeLa和SiHa過表達(dá)miR-7-5p 10d后，6孔板中陰性對照組和miR-7-5p mimics轉(zhuǎn)染組的克隆形成數(shù)分別為(83±11)個和(129±21)個、(25±7)個和(14±8)個，過表達(dá)miR-7-5p的細(xì)胞集落形成能力明顯弱于空陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.359、9.641，均P<0.05)，見圖5C。

圖5 過表達(dá)miR-7-5p抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和克隆形成能力Fig.5 miR-7-5p inhibits the proliferation, invasion and colony formation capacity of cervical cancer cellsA: miR-7-5p過表達(dá)后對HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞增殖能力的影響；B: miR-7-5p過表達(dá)后對HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響；C: miR-7-5p過表達(dá)后對HeLa和SiHa細(xì)胞克隆形成能力的影響；**P<0.01

3 討 論

目前，TFF3在惡性腫瘤中的表達(dá)與功能已有報道。有研究顯示TFF3高表達(dá)的乳腺癌患者更容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[11]，TFF3與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及較晚的TNM分期具有明顯的相關(guān)性，TFF3高表達(dá)的患者生存期明顯縮短[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中，TFF3的表達(dá)也呈高水平；敲減TFF3的表達(dá)，可使宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和克隆形成能力明顯減弱。說明TFF3在促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和實現(xiàn)自我更新的過程中發(fā)揮重要作用，或以癌基因的形式推進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

miRNA在轉(zhuǎn)錄后基因的調(diào)控中扮演至關(guān)重要的角色。miRNA通過參與癌癥發(fā)生的代謝網(wǎng)絡(luò)，并改變機體的表觀遺傳而與腫瘤發(fā)展和預(yù)后發(fā)生密切的關(guān)聯(lián)。目前，利用小分子成合成抑制劑抑制蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)的技術(shù)有很大進(jìn)步，但在實際應(yīng)用中卻困難重重，所以對于腫瘤的治療需要更有效的方法，而以miRNA模擬物或抑制劑作為腫瘤靶向治療技術(shù)是一種潛在治療策略，受到廣泛關(guān)注[14-15]。因此，開展針對癌基因的miRNA驗證研究可能為腫瘤的防治提供新的思路。在本研究中，體外細(xì)胞實驗證明TFF3促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，而深入研究該基因發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p可靶向結(jié)合TFF3 3′UTR位點，并顯著下調(diào)宮頸癌細(xì)胞TFF3的表達(dá)，在細(xì)胞功能方面，過表達(dá)miR-7-5p可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和克隆形成能力。

綜上，本研究初步證明miR-7-5p靶向調(diào)控TFF3可抑制宮頸癌的增殖和轉(zhuǎn)移功能。腫瘤的靶向治療一直以來都是腫瘤研究的熱點，期望本研究為腫瘤靶向治療提供新的靶點，同時為宮頸癌的防治提供新的思路。