不同方法誘導小鼠胚胎成纖維細胞直接轉化為神經干細胞效率的比較

紀瓊瓊， 李明華， 王培軍

(同濟大學附屬同濟醫院醫學影像科，上海 200065)

神經干細胞(neural stem cells, NSCs)因具有自我更新和多向分化潛能而備受關注，以NSCs為基礎的細胞替代治療成為近年來的研究熱點。很多研究證明NSCs移植治療可以改善多種神經退行性疾病、外傷導致的神經細胞受損等疾病的癥狀[1-2]。研究者們通過使胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)體外分化獲取NSCs[3]、體細胞經誘導轉化為誘導型多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)[4]等方法完善細胞替代治療。但上述兩種方法均存在自身難以克服的弊端： 前者的獲取無法通過倫理認證；后者存在明顯的致瘤風險。2012年，Han等[5]成功將體細胞轉化為誘導型NSCs(induced neural stem cells, iNSCs)，iNSCs具有和NSCs相似的自我增殖能力和多向分化潛能，組織來源豐富，無致瘤性，無倫理限制，成為神經系統疾病細胞替代治療的理想細胞。

很多研究表明轉錄因子Sox2是誘導轉化過程中的關鍵誘導因子。RING等[6]通過單誘導因子Sox2成功將小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)轉化為iNSCs，并證明其他因子的添加并未提高轉化的效率。2016年，Han等[7]采用丙戊酸(VPA)、Bix01294、RG108、PD0325901、CHIP99021、A83-01及維生素C(VC)等7種小分子物質成功將MEFs轉化為iNSCs。目前的轉化方法尚存在轉化效率低的問題，無法滿足iNSCs的基礎研究和臨床應用需求，本實驗采用單獨利用誘導因子Sox2，單獨利用小分子物質，Sox2和小分子物質共同作用3種方法將MEFs轉化誘導為iNSCs，比較3組的轉化效率旨在探索小分子物質的添加是否可以提高單因子Sox2的誘導效率。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

孕14d C57小鼠購于上海南方模式生物有限公司；胎牛血清、DMEM高糖培養基、L-谷氨酰胺、N2添加物、B27添加物、含EDPA的胰酶、牛血清白蛋白(BSA)購于美國Gibco公司；NeuroCultTM細胞增殖試劑盒、D-PBS購于加拿大StemCell公司；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)購于美國PeproTech公司；兔抗小鼠巢蛋白(nestin)、兔抗小鼠微管相關蛋白2(MAP2)、兔抗小鼠膠質細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)、兔抗小鼠波形蛋白(vimentin)購于美國Abcam公司；VPA、Bix01294、RG108、PD0325901、CHIP99021、A83-01及VC等購于美國MCE公司。本實驗所使用動物相關實驗方法均依據國際實驗動物使用及照顧相關方法，通過同濟大學附屬同濟醫院動物福利倫理委員會審查。

1.2 細胞培養基

MEFs培養基： DMEM高糖培養基、10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素；NSCs和MEFs轉化培養基： DMEM/F12、B27(50×)、EGF儲存液(5000×)、bFGF儲存液(5000×)、青霉素/鏈霉素(100×)；NSCs分化培養基： DMEM/F12、5%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和1μmol/L維甲酸(RA)。

1.3 MEFs和NSCs的提取

將孕14d的C57小鼠頸椎脫臼處死，乙醇消毒全身，取出胚胎置于4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)中，體視顯微鏡下去除內臟及四肢，保留頭部并提取NSCs，從軀干部分提取MEFs。剝除胎鼠頭顱皮膚、顱骨、腦膜，小心分離大腦皮層，置于4℃ PBS中用巴氏吸管反復吹打至均勻的懸液，250×g離心5min，PBS清洗2～3次，加入適量培養基重懸培養。將軀干部分組織剪碎，0.25%胰酶室溫下消化20min，用巴氏吸管反復吹打至均勻懸液，加入等體積MEFs培養基終止消化，70μm篩過濾去除較大組織塊，250×g離心5min，PBS清洗2～3次，培養于適量MEFs培養基中。

1.4 慢病毒表達載體的構建

本實驗選擇慢病毒表達載體pLenti6.3-MCS，排除Sox2基因自身的酶切位點，選擇酶切位點Asc1和Pme1作為目的基因的插入位點。用293T細胞進行Sox2的過表達慢病毒包裝。

1.5 將MEFs誘導轉化為iNSCs

用多聚鳥氨酸/層粘連蛋白包被24孔板內的細胞爬片。將細胞分為5組： S組，單獨使用誘導因子Sox2；M組，單獨使用7種小分子物質；S+M組，使用誘導因子Sox2聯合7種小分子物質；CT組，未轉染的野生型MEFs；NC組，加入空白質粒。采用1/2小體積感染法，24h后換NSCs的完全培養基，隔天換液，共誘導7d，誘導開始后的第5天，免疫熒光顯微鏡下計數5個不同爬片nestin陽性細胞數目，以計算3組細胞向NSCs轉化的轉化效率。NSCs轉化率=(nestin陽性細胞數/MEF起始細胞數)×100%。

1.6 iNSCs的誘導分化

為進一步比較3組所產生的iNSCs的分化能力，將iNSCs懸浮培養，7d聚集成球，消化后重懸，接種于Matrigel膠包被的24孔板的細胞爬片中。第2天換NSCs分化培養基，隔天換液，培養7～14d用免疫熒光法檢測神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。

1.7 免疫熒光染色

將細胞爬片用PBS漂洗5min，共3次；4%多聚甲醛固定20min；PBS清洗5min，共3次；1%曲拉通×100透膜30min；PBS清洗5min，共3次；免疫熒光封閉液封閉30min，PBS清洗5min，共3次；加入一抗4℃濕盒內孵育過夜，吸棄一抗溶液，PBS清洗5min，共3次；加入二抗溶液室溫孵育2h，吸棄二抗溶液，PBS清洗5min，共3次；DAPI核染10min，吸棄核染溶液，PBS清洗5min，共3次；封片，免疫熒光顯微鏡下觀察并計數熒光蛋白的表達量。其中一抗稀釋比例1∶200，二抗稀釋比例1∶500。

1.8 實時定量聚合酶鏈反應(q-PCR)

通過q-PCR檢測3組所產生的iNSCs在NSC相關基因及多能性相關基因的表達水平。將3組誘導產生的iNSCs、MEFs及iPSCs用PBS沖洗3次，采用TRIzol法提取總RNA。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，采用隨機引物使用TaKaRa qPCR檢測試劑盒對cDNA進行PCR擴增，各標記基因引物見表1。

表1 引物序列

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 MEFs及NSCs的鑒定結果

從胎鼠內提取的MEFs及NSCs傳代培養至P3時基本純化，生長狀態良好，MEFs呈長梭形，免疫熒光的結果顯示MEFs對成纖維細胞標記蛋白vimentin及α-SMA呈陽性，見圖1。vimentin的陽性率為(97.2±1.5)%、α-SMA為(96.3±1.9)%。提取的原代細胞確定為成纖維細胞，且細胞的純度較高。NSCs懸浮生長并可形成神經球，NSCs對NSCs標記蛋白Sox2和nestin呈陽性，見圖2。Sox2的陽性率為(98.3±1.7)%，nestin為(98.9±1.6)%，提取的原代細胞確定為NSCs，且純度較高。

圖1 免疫熒光鑒定MEFsFig.1 Immunofluorescence staining of MEFsA1～A3為光鏡下MEFs的形態，B1～B3顯示MEFs對α-SMA呈強陽性；C1～C3顯示MEFs對vimentin呈強陽性

圖2 免疫熒光鑒定NSCsFig.2 Immunofluorescence staining of NSCsA1、A2為光鏡下NSCs形成神經球的形態，A3為光鏡下NSCs單層貼壁生長時細胞的形態；B1～B3顯示NSCs對nestin呈強陽性；C1～C3顯示NSCs對Sox2呈強陽性

2.2 將MEFs誘導轉化為iNSCs

誘導開始后的4～6d，除了CT組和NC組，其他3組細胞的形態發生改變，細胞由梭形變得細長，相互之間連接成網狀,并逐漸懸浮形成神經球的狀態，見圖3。免疫熒光染色結果顯示部分細胞對nestin的染色呈強陽性，見圖3。高倍顯微鏡下分類計數的結果顯示： S組的轉化率為1.32(1.27,1.47)%，M組的轉化率為1.16(0.95,1.23)%，S+M組的轉化率為2.53(2.17,2.60)%，CT組和NC組的轉化率為0%。

誘導開始后的第8天，將細胞消化后置于低吸附培養瓶中，隔天換液。4～5d后，3組內皆可看到神經球形成，免疫熒光染色結果顯示3組所形成的神經球均對nestin和Sox2呈強陽性，見圖4。qPCR的結果顯示3組所產生的iNSCs均表達多種NSC標志基因(Sox2、Pax6、Zbtb16)，表達水平均較MEFs明顯增高(P<0.05)，但3組之間差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5。3組的iNSCs不表達多潛能相關基因Oct4、Nanog、Zfp42，3組間差異性無統計學意義(P>0.05)，見圖6。

2.3 iNSCs具有自我更新能力和多向分化潛能

為了證明3種方法所形成的iNSCs具有多向分化的能力，將iNSCs置于多聚鳥氨酸/層粘連蛋白包被的6孔板中進行誘導分化，培養2周，熒光顯微鏡下可見成熟神經元(MAP2染色陽性)，星形膠質細胞(GFAP染色陽性)，少突膠質細胞(Olig2染色陽性)的形成，見圖7。3組iNSCs具有多向分化的能力，且3組細胞之間不具有顯著性差異。

圖4 iNSCs神經球的形態及免疫熒光鑒定神經球Fig.4 The morphology and immunofluorescence staining of neurospheres光鏡下見3組iNSCs形成神經球的形態；3組iNSCs對nestin呈陽性；3組iNSCs對Sox2呈陽性

圖5 NSCs標記基因在各組中表達量的比較Fig.5 The expression levels of NSCs marker genes in each groupCT組為MEFs

圖6 多潛能性相關基因在各組中表達量的比較Fig.6 The expression levels of pluripotency-related genes in each groupCT組為iPSCs

3 討 論

NSCs因具有自我增殖和分化能力而對再生醫學具有重大意義，它可以作為種子細胞用于治療多種神經系統疾病，也可以用于藥物篩選和毒性試驗等[6,8]。基礎實驗研究和臨床應用均要求獲取足量的NSCs，但NSCs來源受限并受倫理約束。利用體細胞直接重編程為iNSCs則規避了上述方法的局限性。而且，將體細胞直接誘導轉化為NSCs的方法組織來源豐富，可避免免疫排斥反應；另外，大量的研究表明iNSCs移植到小鼠腦內不存在致瘤性。因此，體細胞誘導產生的iNSCs為NSCs的研究提供了更好的選擇[6]。

近年來，全球各個實驗室通過不同的方法成功將體細胞直接轉化為iNSCs,并證明iNSCs具有和野生型NSCs相似的功能。多數研究使用不同轉錄因子組合誘導體細胞向iNSCs轉化[9-10]，但是外源基因及細胞基因組的整合及病毒載體與細胞的整合都將帶來一些難以預料的后果。所以減少外源基因的數量成為降低風險的一種方式。Ring等[6]成功利用單轉錄因子Sox2將MEFs轉化為iNSCs，并證明此種轉化方法可以激活內源性Sox2的表達,即轉化誘導的細胞不需要外源性Sox2來維系NSCs功能狀態，可以穩定傳代40代以上。Han等[7]通過在培養基中添加7種小分子物質將MEFs轉化為NSCs。VPA可通過抑制組蛋白去乙酰化酶而提高MEFs向iPSCs的轉化效率[11]；Bix01294是一種G9a HM色氨酸合成酶的抑制劑，可提高細胞重編程的效率[12]；RG108是一種DNA甲基轉移酶抑制劑，可以提高MEFs向iPSCs的轉化效率[13]；PD0325901可以抑制MAPK/ERK信號通路，提高ESCs自我更新能力[14]；CHIP99021是一種糖原合成激酶3β的抑制劑，可以激活Wnt信號通路[14]；A83-01通過抑制Smad2的磷酸化作用而抑制TGF-β介導的上皮細胞向間充質細胞的轉化[15]；VC是雙加氧酶反應中的輔因子，可以提高iPSCs的產生[16]。此種方法轉化效率可達2%，所形成的iNSCs具有穩定的自我增殖能力和多向分化潛能。但是，這兩種方法的轉化效率均較低。因此，本實驗通過比較3種誘導方法的轉化率證明兩種方法的聯合可以提高體細胞向iNSCs的轉化效率，而不改變iNSCs的自我更新能力和多向分化潛能(如免疫熒光及PCR結果所示)。

本實驗結果證明，轉錄因子和小分子物質具有協同作用，可以在提高MEFs向iNSCs轉化效率的同時并不改變iNSCs的自我增殖能力及多向分化潛能。通過兩種方法的組合提高轉化效率可獲得穩定的iNSCs。但本實驗尚存在很多不足： (1) 為了提高轉化的成功率，以便于轉化效率的比較，本研究暫時只使用MEFs進行誘導轉化；(2) 實驗雖然證明兩種方法的組合可以提高轉化效率，但是具體的機制尚不明確，有待進一步研究；(3) 本實驗暫時只停留在細胞水平，未進行動物實驗以證明所轉化的細胞可以在活體內存活、分化，對神經系統性疾病起治療作用。

總之，本研究證明小分子物質與單因子Sox2的聯合作用可以提高MEFs轉化為iNSCs的效率，且并不影響所產生的iNSCs的自我增殖能力及多向分化能力，為投入大量iNSCs進行基礎實驗研究提供便捷，但具體的機制及各個小分子的作用值得進一步研究。