肝膽腫瘤組織中PD-L1的表達水平及臨床病理研究

谷曉媛， 張為強， 陸新元

(1. 上海市靜安區市北醫院腫瘤科，上海 200443； 2. 上海市東方肝膽外科醫院病理科，上海 200438)

原發性肝癌是我國第4位常見惡性腫瘤和第3位的腫瘤致死病因，嚴重地威脅我國人民的生命和健康[1-3]。在我國，由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)和/或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染等多種原因引起的肝硬化等危險因素的存在，肝癌發病率居高不下，且多數患者就診時已發展至進展期或存在遠處轉移，已經失去手術機會而難以達到理想療效，預后極差。

程序性死亡受體1(programmed cell death 1, PDCD1，也稱PD-1)作為重要的免疫檢查點，可見于多種免疫細胞如活化的T細胞、NK細胞、B細胞等[4]。腫瘤微環境可誘導腫瘤細胞高表達PD-1的配體程序性死亡受體配體1(programmed cell death 1 ligand 1, PDCD1LG1，也稱PD-L1)，PD-L1通過與PD-1結合，負性調節T細胞功能，抑制T細胞增殖，抑制細胞毒性T淋巴細胞的活性，同時抑制細胞因子如白細胞介素-2、干擾素-γ等的產生，從而促進腫瘤的免疫逃逸[5-6]。因此，使用阻斷劑阻斷PD-1和PD-L1間的相互作用，可恢復T細胞的活性和殺傷腫瘤細胞的能力，這是目前臨床治療中使用PD-1/PD-L1抗體進行免疫治療的理論依據。近年來以PD-1/PD-L1為免疫檢查點的免疫新療法取得突破性進展，也為肝癌治療帶來了新的曙光[7]。根據中國臨床腫瘤學會(Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO)指南推薦，晚期肝細胞癌的一線治療策略推薦索拉非尼、侖伐替尼、奧沙利鉑為主的系統化療，二線推薦瑞戈非尼、PD-1單抗(包括納武單抗、派姆單抗等)。PD-L1在肝臟腫瘤中的表達研究已見報道[8]，但多數研究選用抗體并非FDA指定的診斷試劑，本研究擬使用FDA指定的診斷試劑檢測我國肝膽系統腫瘤組織內PD-L1的表達水平，并探討其表達與臨床病理參數之間的關系，為進一步研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月1日—2018年10月31日于東方肝膽外科醫院行手術治療、由同一病理科醫師進行診斷的肝膽系統原發惡性腫瘤病例，共434例，包括347例肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、37例肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)、7例肝細胞-膽管細胞混合型肝癌(combined hepatocellular-cholangiocarcinoma, cHCC-CCA)、43例肝外膽管癌(包括肝門部膽管細胞癌及末端肝外膽管細胞癌)。收集347例HCC病例的年齡、性別、AFP、HBsAg、腫瘤大小、組織學類型、分化程度、微血管侵犯(microvascular invasion, MVI)、子灶、肝硬化情況、T分期等臨床病理參數。

其中分化程度采用國際上常用的Edmondson-Steiner級(Ⅰ～Ⅳ)分級法；組織學類型常見有細梁型、粗梁型、假腺管型和團片型等，特殊細胞類型如透明細胞型、富脂型、梭形細胞型和未分化型等。MVI是指在顯微鏡下于內皮細胞襯覆的脈管腔內見到癌細胞巢團，以門靜脈分支為主(含包膜內血管)，分為： M0，未發現MVI；M1(低危組)，≤5個MVI且發生于近癌旁肝組織；M2(高危組)，>5個MVI或MVI發生于遠癌旁肝組織[9]。根據國際癌癥聯盟/美國癌癥聯合會肝癌分期標準進行原發灶分期、即T分期。

1.2 儀器與試劑

PD-L1抗體、試劑盒為安捷倫公司的診斷試劑套裝(PD-L1 IHC PharmDx, Santa Clara, CA，美國)，并使用配套免疫組化檢測系統(Dako Autostainer Link 48 platform, Dako, Carpinteria, CA)。鼠抗人肝細胞(Hep Par 1)單克隆抗體(Clone OCH1E5)、細胞角蛋白19(Cytokeratin 19, CK19)抗體購自Dako公司。二抗及顯色試劑盒采用Leica公司的BondTMPolymerRefine Detection，Hep Par 1及CK19免疫組化由全自動免疫組化染色機(Leica BOND-MAX)完成。切片觀察采用Nikon ECLIPSE TE2000-U型顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 H-E染色 按照常規方法(取材、固定、脫水、包埋、切片、展片、撈片)制作石蠟切片，二甲苯脫去切片中的石蠟，再經由高濃度到低濃度乙醇脫水、最后入蒸餾水進行水化，之后即可進行蘇木精-伊紅(H-E)染色。具體步驟如下： 將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色5min，鹽酸乙醇分化15s后自來水沖洗15min后入蒸餾水2min。入75%和85%乙醇中脫水各2min。入乙醇伊紅染色液染色1min。染色后的切片經無水乙醇脫水，再經二甲苯使切片透明、中性樹膠封片后鏡檢。

1.3.2 免疫組化染色 常規石蠟包埋組織切片，PD-L1免疫組化染色應用上述指定的Dako診斷試劑、按照說明書操作步驟進行，根據PD-L1表達情況分為PD-L1陽性及PD-L1陰性組。陽性定義為腫瘤比例評分(tumour proportion score, TPS)≥1%[9]。Hep Par 1及CK19免疫組化采用上述一抗試劑、配套試劑盒、全自動生化儀按照說明書步驟進行染色，根據染色結果判斷為陽性及陰性。

1.4 統計學處理

比較PD-L1陽性及PD-L1陰性組上述臨床病理參數之間的差異，采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1在不同類型肝膽系統惡性腫瘤中的表達情況

347例HCC腫瘤組織內PD-L1的陽性率為21.6%(75/347)，略低于ICC組的29.7%(11/37)，但差異無統計學意義(P=0.26)，高于cHCC-CCA組及肝外膽管癌組的14.3%(1/7，P=0.536)和6.98%(3/43，P=0.024)。PD-L1在不同病理類型肝膽惡性腫瘤組織內的表達結果見圖1。圖1A、B顯示HCC腫瘤細胞排列呈梁索狀，包膜內癌栓組織PD-L1呈細胞膜/質表達；圖1C、D顯示ICC呈腺管或巢狀排列，纖維間質豐富，PD-L1以細胞膜表達為主；圖1E、F顯示cHCC-CCA中的肝細胞癌成分呈梁索狀，但細胞間排列較松散，細胞異型性大，PD-L1在腫瘤細胞中呈細胞膜/質表達；圖1G、H顯示低分化肝外膽管癌腫瘤排列呈巢狀或腺樣，細胞異型明顯，間質內見淋巴細胞浸潤，PD-L1在腫瘤細胞中呈細胞膜/質表達。

2.2 雙表型肝細胞癌組織內PD-L1的表達情況

347例HCC各組織學亞型的PD-L1陽性率分別為： 粗梁型21.5%(60/279)、細梁型5.9%(1/17)、團片型25%(1/4)、假腺管型0(0/3)、透明細胞型15.4%(2/13)、DPHCC 39.3%(11/28)、硬化型0(0/2)、紫癜型0(0/1)。28例DPHCC組織內PD-L1的陽性率(39.3%，11/28)顯著高于其他亞型的PD-L1陽性率(20.1%，64/319)，差異具有統計學意義(P=0.018)。

雙表型肝細胞癌(dual-phenotype hepatocellular carcinoma, DPHCC)是HCC的一種特殊亞型，常規H-E染色提示顯示腫瘤細胞排列呈粗梁型，細胞多邊形，核大深染，異型明顯(圖2A，×200)，Hep-Par-1免疫組化染色顯示腫瘤細胞胞質染色陽性(圖2B，×200)，CK19染色顯示腫瘤細胞胞膜及胞質染色陽性(圖2C，×200)，PD-L1染色顯示腫瘤細胞胞膜及胞質染色陽性(圖2D，×400)。

2.3 HCC中PD-L1的表達與臨床病理參數之間的關系

統計分析結果見表1。PD-L1陽性組與陰性組患者以下臨床病理參數間差異無統計學意義，包括年齡、性別、AFP陽性、HBsAg陽性、肝硬化有無、腫瘤大小、子灶有無。在微血管侵犯方面，PD-L1陽性組的MVI陽性率為37.3%，顯著高于PD-L1陰性組的21%(P=0.003)；PD-L1陽性組的Ⅲ～Ⅳ級分化比例顯著高于PD-L1陰性組(P=0.016)，說明PD-L1陽性組病例分化較差；PD-L1陽性組的CK-19陽性率為12%，顯著高于PD-L1陰性組的5.1%(P=0.035)；在T分期方面，PD-L1陽性組病例的T3期(包括T3a及T3b)比例為20%，顯著高于PD-L1陰性組病例的11%(P=0.004)，說明PD-L1陽性病例的分期較晚。

圖1 PD-L1在不同病理類型肝膽惡性腫瘤組織內的表達(H-E，×200)Fig.1 PD-L1 expression of in different pathological types of malignant hepatobiliary tumor tissues (H-E，×200)A、B: HCC；C、D: ICC；E、F: cHCC-CCA；G、H: 肝外膽管癌

圖2 DPHCC免疫組織化學染色結果Fig.2 Results of DPHCC immunohistochemical stainingA: H-E染色，×200；B: Hep-Par-1染色，×200；C: CK19染色，×200；D: PD-L1染色，×400

3 討 論

美國FDA已批準PD-1或PD-L抗體治療多種惡性腫瘤，包括非小細胞肺癌、晚期腎癌、復發或轉移性尿路上皮癌、經典霍奇金淋巴瘤、晚期復發的頭頸部鱗癌、黑色素瘤、不可切除的晚期或復發型胃癌、經過標準治療后進展的微衛星不穩定型或錯配修復基因缺陷型實體腫瘤，當然也包括肝細胞癌[10]。2017年9月23日，FDA批準納武單抗(nivolumab)用于接受過索拉非尼治療后的HCC患者，成為首個在肝癌上獲FDA批準的免疫藥物，標志著肝癌治療正式進入免疫時代。2018年11月上旬美國FDA加速批準默沙東公司的派姆單抗(pembrolizumab，商品名Keytruda)用于治療已經接受過索拉非尼治療的晚期HCC患者。本次批準是基于Keytruda在名為KEYNOTE-224的2期臨床研究中的表現[10]。在這項非隨機、多中心、開放標簽的2期臨床試驗中，104例HCC患者接受了Keytruda的治療。他們曾經接受過索拉非尼的治療，但是對療法不耐受或者疾病繼續惡化。試驗結果表明，患者的客觀緩解率為17%，其中1%的患者出現完全緩解，44%的患者疾病狀態穩定。在出現緩解的患者中，89%的患者緩解期超過6個月，56%的患者緩解期超過12個月。但PD-1或PD-L1抗體治療原發性肝癌等惡性腫瘤，其治療效果決定于腫瘤細胞是否表達PD-1和PD-L1，低表達或不表達PD-L1或PD-1的腫瘤抗體治療效果欠佳，反之則具有較好的療效[10,12]。

Dai等[7]檢測到90例HCC病理組織內PD-L1的高表達率為41.11%(37/90)，Ma等[13]研究表明，70例肝外膽管癌組織內的PD-L1陽性率為42.86%(30/70)，而Walter等[14]在11.6%(8/69)的肝外膽管癌組織內發現了PD-L1的表達。但上述研究所用的檢測抗體均為科研試劑，并非FDA批準的納武單抗或派姆單抗的配套檢測試劑。KEYNOTE-224試驗[10]使用了派姆單抗的配套檢測試劑，檢測出PD-L1 TPS≥1%的比例僅為13%(7/52)，但根據該試驗標準入選的病例不能代表總體HCC人群，且樣本量較少。本研究報道了派姆單抗的配套PD-L1檢測試劑在大樣本肝膽系統惡性腫瘤組織內的陽性率，類似結果未見報道。

臨床參數PD-L1表達陽性(n=75)陰性(n=272)P值年齡/歲54.76±10.0255.51±10.610.585男∶女63∶12233∶390.719AFP陽性(≥20ng/mL)64(85.3)207(76.1)0.087HBsAg陽性59(78.7)194(71.3)0.205微血管侵犯(MVI) M047(62.7)215(79.0) M114(18.67)38(14.0)0.003 M214(18.67)19(7.0)分化Ⅲ～Ⅳ級74(98.7)245(90.1)0.016肝硬化陽性47(62.7)148(54.4)0.202腫瘤大小/mm64.88±42.9963.00±44.510.745CK19陽性9(12.0)14(5.1)0.035子灶陽性11(14.7)39(14.3)0.943T分期 T135(46.7)180(66.2) T225(33.3)62(22.8)0.004 T3a8(10.7)23(8.5) T3b7(9.3)7(2.6)

Calderaro等[15]分析了PD-L1在217例肝癌組織中的表達及其與臨床病理學參數的關系。結果顯示，17%(36/217)的肝癌細胞存在PD-L1表達，肝癌細胞中PD-L1的高表達與腫瘤侵襲性呈正相關如高血清AFP水平、子灶存在、MVI、低分化、CK19表達。本研究通過對347例HCC病例深入研究發現，伴微血管浸潤、T分期較晚(T3a/3b)、DPHCC、分化差(Ⅲ～Ⅳ)的HCC組織內PD-L1陽性率較高，提示該類人群可能成為PD-1/PD-L抗體治療的優勢人群。本研究通過對我國人群更大樣本的病例研究，發現HCC組織中PD-L1的陽性率為21.6%、略高于Calderaro研究結果，因本研究采用的抗體試劑為病理診斷試劑、與前述Calderaro等所用的科研試劑有所不同，故而結果不同。

DPHCC是2011年報道的一種HCC亞型，發生率約占HCC的10%[16]。DPHCC是指在組織病理學上表現為典型的HCC，但以同時表達任意HCC標志物(如HepPar-1、pCEA、arginase等)和任意ICC標志物(如CK19、CK7、MUC-1等)為基本特征，因具有HCC和ICC的雙重生物學行為，微血管侵犯和肝內外轉移的發生率更高，臨床預后更差，相比較于CK7和MUC-1等膽管細胞標志物，CK19顯示出較高的敏感性和特異性，是病理學診斷膽管癌和DPHCC的最常用標志物之一。DPHCC僅表現出單一的HCC組織學成分，但其細胞呈雙向分化和雙向基因開放的特點，這不同于經典的cHCC-CCA[16-17]，后者是指在一個腫瘤結節內含有明確的HCC和ICC兩種組織學成分，并分別表達HCC和ICC的免疫組織化學標志物[18]。DPHCC可能來源于具有雙向分化潛能的肝臟干/祖細胞[16]。Almozyan等[19]對TCGA侵襲性乳腺癌基因表達數據庫進行分析，發現PD-L1的表達與乳腺癌干細胞密切相關，并且證實了PD-L1通過調節PI3K/AKT通路，在維持乳腺癌干細胞的干性中發揮關鍵作用，提示抗PD-L1治療可殺傷乳腺癌干細胞從而提升乳腺癌的療效。Miller等[20]亦研究發現結腸癌中SOX2陽性的結腸癌干細胞受到免疫相關因子FoxP3及PD-L1的調節。Calderaro等[15]亦發現PD-L1表達于特定肝癌亞型如CK19表達>5%的肝細胞癌，這一肝細胞癌亞型被認為來源于肝臟干/祖細胞，推測PD-L1的表達可能通過抑制免疫殺傷效應而加強其侵襲性，但未就其機制進行深入探討。本研究提示，DPHCC的PD-L1陽性率顯著高于其他HCC亞型，與Calderaro等研究一致。因此大膽提出假設： 推測PD-L1的表達水平可能與腫瘤細胞的“干性”有一定關系。這一假設可部分解釋DPHCC的生物學特性與PD-L1高表達之間的聯系，有待于未來分子生物學實驗的進一步證實。

本研究采用標本診斷試劑和大樣本檢測了我國肝膽腫瘤組織內PD-L1的表達情況，并且較為深入地分析了PD-L1的表達與臨床病理參數間的關系，并且觀察到PD-L1在DPHCC這一特定亞型的高表達情況。今后研究方向應著眼于探究PD-L1的表達在DPHCC發生、發展中的作用及機制，以期為DPHCC這一高侵襲性HCC的治療提供初步的理論依據。