MLN4924對索拉非尼耐藥肝細胞癌細胞中neddylation修飾的抑制作用

孫 杰，劉 淦，李因茵，陸蔭英

肝癌是世界發病率第六位高的癌癥，肝癌患者病死率在所有癌癥中位居第二，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是發病數最高的肝癌亞型，約占80%～90%。目前HCC的治療主要依賴于外科手術，局部區域和系統性治療方法[1-2]。在HCC早期階段，主要運用外科手術對肝臟進行切除和移植；在中期階段，主要采用消融療法以及肝動脈化療栓塞術等局部區域治療，這些方法既能夠與外科手術相互結合，也能夠用于不適合手術的病例；在HCC的晚期階段，對于不可進行肝切除或具有轉移性HCC的患者，索拉非尼是惟一的一線系統性靶向藥物。索拉非尼是口服的多靶點、多激酶抑制劑，于2007年被美國FDA批準用于HCC的治療[3]。盡管HCC具有很多治療手段，但患者的預后水平整體較差，僅有10%的HCC患者生存期超過5年。腫瘤復發是患者肝切除后5年內面臨的一個巨大問題，而索拉非尼僅能延長約3個月的生命，對晚期HCC的治療作用十分有限[4-5]。因此，綜合與深入的研究HCC的發生、發展機制，開發新型有效的治療手段，對于HCC患者的治療和預后具有重要意義。

類泛素化修飾neddylation是一種蛋白質的翻譯后修飾，能夠調控細胞周期、細胞代謝和細胞內信號轉導。蛋白質的neddylation修飾異常與腫瘤的發生、發展密切相關[6-7]。neddylation是由泛素激活酶E1，泛素偶聯酶E2和泛素連接酶E3所介導的三步酶聯反應組成。首先，神經前體細胞表達的發育性下調蛋白8（neuronal precursor cellexpressed developmentally down-regulated protein 8, NEDD8）通過其C端的甘氨酸與泛素激活酶NAE的半胱氨酸活性位點形成一個高能硫酯鍵。其中，泛素激活酶NAE是由泛素樣修飾酶激活酶 3（ubiquitin like modifier activating enzyme 3,UBA3）與淀粉樣前體蛋白結合蛋白1（amyloid precursor protein-binding protein 1, APPBP1） 組 成的異源二聚體。隨后，經過轉硫醇活化反應，活化的NEDD8被轉移至泛素結合酶UBC12（ubiquitinconjugating enzyme E2M）上。最后，泛素連接酶E3將NED88轉移到底物蛋白上完成對特異蛋白的neddylation 修飾[8]。

MLN4924是近年來發現的一種neddylation小分子蛋白抑制劑，能夠抑制癌細胞的增殖和遷移，在臨床前研究中具有顯著的抗癌功效，目前已經進入了部分實體腫瘤和惡性血液病的Ⅰ期臨床試驗[9-13]。MLN4924能夠通過與泛素激活酶NAE的結合產生共價化合物，從而抑制其活性，導致底物積累，進而引發DNA損傷反應，細胞周期停滯，細胞凋亡，以及細胞的自噬和衰老，抑制腫瘤細胞的生長[10，14]。但neddylation在HCC發生、發展中的作用，以及MLN4924在治療HCC中的功效目前并不完全清楚。因此，本課題組對MLN4924在具有索拉非尼耐藥性HCC細胞中的抗癌效果和機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2和Huh-7細胞系購自美國ATCC細胞庫。抗NEDD8，APPBP1和Actin抗體購自Abcam公司。抗UBA3抗體購自GeneTex。抗UBC12抗體購自于Cell signaling。CCK試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。索拉非尼和MLN4924抑制劑購自Selleckchem公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養 HepG2和Huh-7細胞培養條件為含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素的DMEM培養基，細胞培養在37 ℃，5 %CO2培養箱中。

1.2.2 CCK檢測細胞增殖 取對數生長期 HepG2或Huh-7 細胞，以每孔 2000個細胞接種于 96孔板，每孔加150 μl培養基，細胞接種24 h后，按照實驗設計的濃度梯度（0/0.25/0.50/1.00 μM）加入抑制劑MLN4924，培養后每孔加入 CCK-8 溶液 10 μl，繼續培養 1～2 h；在酶標儀上測量各孔吸光度值，測定波長450 nm，記錄結果并繪制細胞增殖曲線。

1.2.3 蛋白印跡實驗 將HepG2和Huh-7細胞裂解后進行蛋白 SDS-PAGE，將膠浸泡于電轉液中（Tris 25 mM，甘氨酸 190 mM，20% 甲醇），電泳結束后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，加入10%牛奶封閉1 h，加入封閉液稀釋（抗體稀釋倍數為1∶1000）的一抗后4 ℃過夜。用TBST（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1% 吐溫 20） 洗滌 3 次，加入封閉液稀釋的二抗，37 ℃孵育1 h，洗滌3次，最后用ECL顯色。

1.2.4 索拉非尼耐藥細胞的建立 在HepG2 和Huh-7細胞培養基中添加終濃度為0.25 μM的索拉非尼，初期每周更換1次培養基，中后期根據細胞匯合濃度提高換液頻率。在建立初期，以48 h作為細胞傳代周期；篩選4周后，培養皿中僅存活少量耐藥細胞，將存活的耐藥細胞消化并轉移至規格適宜的培養皿中，以避免細胞密度過低影響生長狀態；繼續保持索拉非尼藥物壓力進行持續培養，并在細胞匯合度到達70%～80%時進行傳代。經過6～7個月的培養，獲得具有在終濃度為0.25 μM的索拉非尼壓力下生存、傳代能力的耐藥細胞，我們在文中稱之為HepG2-Sora和Huh-7-Sora[15]。

2 結 果

2.1 耐藥HCC細胞的NEDD8修飾通路高度活化 用索拉非尼刺激HepG2和Huh-7 HCC細胞，檢測野生型細胞與索拉非尼耐藥細胞中NEDD8的表達量變化。結果顯示，與野生型HepG2和Huh-7細胞相比，索拉非尼耐藥的HepG2-Sora和Huh-7-Sora細胞中NEDD8的蛋白表達量明顯升高（圖1A）。同時我們檢測了與neddylation修飾相關的多個蛋白的表達變化。結果顯示APPBP1、UBA3 和UBC12的表達在耐藥細胞株中都有明顯上調（圖1B）。以上結果提示，與野生型細胞相比，索拉非尼耐藥HCC細胞中NEDD8修飾通路活化。

2.2 MLN4924抑制細胞增殖的劑量依賴性 為了檢測neddylation通路活化對索拉非尼耐藥細胞增殖的影響。我們用不同濃度的索拉非尼（0～4 μM）處理HepG2和Huh-7野生型與耐藥型細胞株，然后再用不同濃度的NEDD8活化激酶抑制劑MLN4924處理細胞。通過檢測細胞增殖情況，我們發現在索拉非尼處理細胞之后，再加入不同濃度的MLN4924 能夠進一步抑制細胞的增殖，并且抑制作用隨著MLN4924抑制劑濃度的增加而增強（圖2）。提示MLN4924能夠抑制索拉非尼耐藥細胞的增殖。

2.3 MLN4924抑制細胞增殖的時間依賴性 分別檢測用2 μM索拉非尼處理后的耐藥細胞HepG2-Sora和Huh-7-Sora，再經MLN4924處理24 h、48 h、72 h和96 h后細胞的增殖情況。結果顯示，Huh-7-Sora受MLN4924處理后細胞增殖明顯減弱，且隨著時間增加抑制效果增強（圖3）。HepG2-Sora在MLN4924處理后24 h，細胞增殖就明顯減弱，隨著時間的延長抑制作用變化不明顯（圖3）。

圖1 耐藥HCC細胞的NEDD8修飾上調Short Exp.索拉非尼短期刺激（8 h）；Long Exp.索拉非尼長期刺激（48 h）；HepG2-WT.野生型HepG2；HohT-WT.野生型HohT-7Figure 1 NEDD8 modification is upregulated in sorafinib-resistant HCC cells

圖2 MLN4924抑制索拉非尼耐藥細胞的增殖Figure 2 MLN4924 inhibits the proliferation of sorafinib-resistant cells

圖3 MLN4924抑制細胞增殖的時間依賴性Figure 3 Time-dependent manner of MLN4924 inhibiting cell proliferation

2.4 MLN4924抑制耐藥HCC細胞的neddylation修飾 考慮到MLN4924對索拉非尼耐藥細胞增殖的抑制作用，我們接下來檢測了經MLN4924處理后索拉非尼耐藥細胞中neddylation修飾的變化情況。通過蛋白印跡實驗，發現MLN4924處理后的索拉非尼耐藥細胞中NEDD8的表達量顯著減少，并且隨著MLN4924濃度的增強NEDD8表達減弱的更加明顯（圖4）。綜上，MLN4924能夠抑制索拉非尼引起的neddylation通路的活化，進而抑制HCC細胞的增殖。

圖4 MLN4924抑制索拉菲尼耐藥HCC細胞的neddylation修飾Short Exp.索拉非尼短期刺激（8 h）；Long Exp.索拉非尼長期刺激（48 h）Figure 4 MLN4924 inhibits neddylation modification in sorafinib-resistant HCC cells

3 討 論

全球每年HCC新發病例數約80萬人，死亡人數約78萬，我國HCC統計數據約占全球統計數據的55%[16]。索拉非尼作為惟一的一線靶向治療藥物，主要通過兩種方式發揮作用：一方面能夠抑制血管內皮生長因子受體和血小板源性生長因子受體，阻礙腫瘤新生血管的生成，減少腫瘤生長所依賴的氧氣、能量的供給；另一方面，能夠阻斷腫瘤細胞中重要信號通路的轉導，抑制腫瘤細胞增殖[17]。然而，索拉非尼對晚期HCC的治療作用十分有限，其在HCC中的反應率還有待提高[18]。主要原因在于HCC具有高度異質性，HCC的發生、發展與多個信號通路的激活相關，對癌細胞內單一信號通路的調控不足以達到良好的治療效果；因此，開發新型有效的治療手段刻不容緩。

細胞內neddylation的失調可導致癌癥的發生，MLN4924作為一種neddylation小分子蛋白抑制劑，其在癌癥治療中的作用受到廣泛關注。有研究報道，MLN4924能夠抑制HepG2和Huh-7細胞系中mTOR信號通路的活性，誘導HCC細胞的自噬和凋亡[19]；并且在人HCC異種移植小鼠模型中，MLN4924表現出了顯著的抗癌效果[19]。我們的研究發現，索拉非尼耐藥HCC細胞HepG2-Sora和Huh-7-Sora的NEDD8修飾通路高度活化，MLN4924能夠通過抑制耐藥細胞株的neddylation，從而抑制其細胞增殖。MLN4924對索拉非尼耐藥細胞株HepG2-Sora的生長抑制效果具有劑量和時間依賴性；而對Huh-7-Sora的抑制效果僅具有劑量依賴性，沒有顯著的時間依賴性。MLN4924的單獨用藥，以及與索拉非尼的聯合用藥均為HCC治療提供新思路。

其他種類癌癥的相關研究表明，MLN4924能夠阻礙胃癌與腎癌細胞的生長和遷移，這主要是通過抑制細胞中Clluin1的neddylation，使Cullin-RING連接酶失活，引發下游多種底物的積累，造成DNA損傷以及細胞周期阻滯[20-21]；MLN4924也能夠抑制人食管鱗狀細胞癌，MLN4924處理導致G2細胞周期阻滯，并增強Wee1樣蛋白激酶，周期素依賴性激酶抑制劑1A/B和p27的蛋白穩定性[22]；在針對復發性淋巴瘤和多發性骨髓瘤的Ⅰ期臨床試驗中，MLN4924表現出了預期的藥效和安全性[23]。

綜上，MLN4924通過抑制細胞內neddylation的修飾，減少了索拉非尼耐受HCC細胞系的生長增殖。我們的研究為HCC細胞的耐藥性及MLN4924的作用機制提供了理論依據，為未來HCC治療手段和策略的開發提供了新的思路。