大豆異黃酮協同索拉非尼對宮頸癌Hela細胞增殖、遷移的影響及機制

姬國杰，豐慧根

(1.新鄉醫學院，河南 新鄉 453003；2.新鄉醫學院三全學院生物與基礎醫學實驗教學中心，河南 新鄉 453000)

宮頸癌在女性癌癥中排第2位，是20～39歲女性癌癥死亡的第二大原因[1]。隨著醫學治療手段的不斷進展，大部分早期宮頸癌可通過手術治療獲得治愈[2]，而對于就診時已處于進展期或發生耐藥的宮頸癌患者，總體預后仍不樂觀[3]。目前，臨床應用的化學治療方案存在不良反應大、藥物利用度低、治療效果不理想等局限。隨著分子靶向治療研究的不斷深入，生物治療這一全新的腫瘤治療模式越來越受到人們的關注，如中西藥聯合應用能夠降低現階段治療宮頸癌的不良反應、增高藥物的利用度或有治療協同作用，將會改善宮頸癌患者的預后。索拉非尼是一種新型的多靶點生物靶向治療藥物[4]，研究表明，索拉非尼能夠誘導Hela細胞的凋亡，抑制其增殖且呈濃度依賴性[5]。大豆異黃酮是一種天然的雌激素，是大豆生長過程中的次級代謝產物，具有抗癌治癌、預防心血管疾病、預防骨質疏松、抗真菌、抗氧化和改善婦女更年期綜合征等多種生理功能，是一類具有開發利用價值的天然活性物質[6-10]。本課題組前期研究表明，大豆苷元能下調宮頸癌細胞血管內皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C) mRNA的表達，且此效果呈劑量依賴性[11]。基于此，本研究采用大豆異黃酮與不同濃度索拉非尼聯合干預宮頸癌Hela細胞，觀察索拉非尼聯合大豆異黃酮干預對宮頸癌Hela細胞的增殖、遷移以及VEGF-C表達的影響，以期為宮頸癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器宮頸癌Hela細胞株由本實驗室保存。RPMI 1640培養基、質量濃度5 g·L-1噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)溶液、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、體積分數30%丙烯酰胺均購自北京索萊寶公司，大豆異黃酮、索拉非尼均購自美國Sigma公司；SYBR PreMix購自大連TaKaRa公司，蛋白酶抑制劑、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、增強型化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測試劑盒、IP細胞裂解液及Western一抗、二抗去除液均購自上海碧云天生物技術有限公司，TRIzol裂解液購自美國Invitrogen公司，兔抗人VEGF-C單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP購自英國Abcam 公司；凝膠成像儀、CO2恒溫培養箱、倒置顯微鏡、落地冷凍高速離心機、實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀購自美國Thermo Scientific公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Olympms公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養將Hela細胞接種于含體積分數10%胎牛血清的1640培養基，調整細胞密度為1×109L-1，置于 37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中培養，培養至細胞融合80%～90%時取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率取對數期的Hela細胞，調整細胞密度約為3×107L-1，按每孔100 μL接種于96孔培養板上，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養至細胞鋪滿每孔底部后棄上清，然后隨機分為對照組、大豆異黃酮組、1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組、1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組；對照組用空白培養基培養，大豆異黃酮組滴加100 μL終濃度為0.04 mmol·L-1的大豆異黃酮，1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組分別滴加100 μL終濃度為1、2、4、6 mmol·L-1的索拉非尼培養，1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組分別滴加100 μL終濃度為1、2、4、6 mmol·L-1的索拉非尼和0.04 mmol·L-1大豆異黃酮，并設置空白對照組(僅加入完全培養基)，設4個復孔；然后，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養48 h；加入10 μL MTT溶液，繼續培養4 h，吸去孔內培養液。每孔加入150 μL 二甲基亞砜，在搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，于波長490 nm處測量各孔的吸光值，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=[1-(加藥組細胞吸光度-空白孔吸光度)/(對照組細胞吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力取對數生長期的Hela細胞，調整密度約為3×107L-1，按每孔1 000 μL接種于6孔板，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養至細胞鋪滿每孔底部后棄上清，用10 μL的槍頭劃線，用生理鹽水清洗1～2次，立即拍照；然后，隨機分為對照組、大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼+索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組，對照組用空白培養基培養，大豆異黃酮組滴加100 μL終濃度為0.04 mmol·L-1的大豆異黃酮，2 mmol·L-1索拉非尼組和4 mmol·L-1索拉非尼組分別滴加100 μL終濃度為2、4 mmol·L-1的索拉非尼培養，2 mmol·L-1索拉非尼+索拉非尼組和4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組分別滴加100 μL終濃度為2、4 mmol·L-1的索拉非尼和0.04 mmol·L-1大豆異黃酮，繼續培養48 h 后，再次拍照記錄；使用Imang J軟件對細胞劃痕面積進行分析，計算細胞遷移抑制率，細胞遷移抑制率=[1-(0 h劃痕寬度-培養后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]×100%，用細胞遷移抑制率表示細胞遷移能力，細胞遷移抑制率越高表示遷移能力越弱。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測Hela細胞中VEGF-C mRNA表達取對數生長期的Hela細胞，調整密度約為3×107L-1，按每孔1 000 μL接種于六孔板，隨機分為對照組、大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組，對照組用空白培養基培養，大豆異黃酮組滴加100 μL終濃度為0.04 mmol·L-1的大豆異黃酮，4 mmol·L-1索拉非尼組滴加100 μL終濃度為4 mmol·L-1的索拉非尼培養，4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組滴加100 μL終濃度為4 mmol·L-1的索拉非尼和0.04 mmol·L-1大豆異黃酮，置于37 ℃、含體積分數5% CO2培養箱中培養48 h；4 ℃條件下，用TRIzol法提取各組細胞總RNA，按試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。應用實時熒光定量PCR法檢測VEGF-C mRNA。引物序列：β-actin上游引物序列為5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′，下游引物序列為5′-AAGGGACTTCCTGTAACAACGCA-3′，產物長度140 bp；VEGF-C上游引物序列為5′-CAGTTACGGTCTGTGTCCAGT-3′，下游引物序列為5′-GGACACACATGGAGGTTTAAAGAAG-3′，產物長度為300 bp。反應體系：SYBR PreMix 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 6.0 μL，cDNA 2.0 μL。反應條件為：95 ℃預變性 3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算VEGF-C mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

1.2.5 Western blot法檢測Hela細胞中VEGF-C蛋白的表達按“1.2.4”項方法進行細胞分組與培養，待細胞長至80%～90%融合時收集細胞，然后滴加IP細胞裂解液+蛋白酶抑制劑(體積比991)于冰上裂解30 min，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心5 min，取上清。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液與蛋白樣品14混合后渦旋震蕩混勻，沸水浴3 min，冷卻至室溫后電泳，取蛋白條帶，半干轉印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)(100 mA，45 min)，在含吐溫-20的Tris緩沖鹽溶液(Tris buffered saline and Tween-20，TBST)中洗膜3次，每次10 min，麗春紅染色液染膜，置于搖床上5 min，蒸餾水漂洗2～3次，TBST清洗2～3次，體積分數5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，將PVDF 膜用TBST清洗3遍，浸入稀釋后(稀釋度1800) 的兔抗人VEGF-C單克隆抗體孵育液中，4 ℃孵育過夜；然后再用HRP 標記的山羊抗兔二抗(稀釋度15 000)孵育1.5 h；ECL發光液染色2 min，加入適量的Western一抗、二抗去除液，TBST漂洗3次，每次 5 min。以β-actin為內參蛋白，用于蛋白測定。應用凝膠成像儀進行圖形采集，Imang J 軟件分析灰度值，以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取均值。

2 結果

2.1 10組細胞增殖抑制率比較對照組、大豆異黃酮組、1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組、1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞增殖抑制率分別為 (0.00±0.00)% 、(1.34±0.16)%、(8.13±1.35)%、(44.09±1.57)%、(65.45±0.24)%、(73.78±2.09)%、(19.68±0.75)%、(57.08±0.57)%、(70.71±0.56)%、(83.31±0.77)%。1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組、1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞增殖抑制率均高于對照組和大豆異黃酮組，差異有統計學意義(P<0.05)；大豆異黃酮組與對照組細胞增殖抑制率比較差異無統計學意義 (P>0.05 )。1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組細胞增殖抑制率隨索拉非尼濃度的增加顯著升高(P<0.05)；1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞增殖抑制率隨索拉非尼濃度的增加顯著升高(P<0.05)；1 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼組、6 mmol·L-1索拉非尼組細胞增殖抑制率分別高于對應的1 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、6 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組，差異有統計學意義(P<0.05 ) 。

2.2 對照組、大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞遷移抑制率比較結果見圖1。對照組、大豆異黃酮組、2 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞遷移抑制率分別為(0.00±0.00)%、(16.81±0.35)% 、(36.70±0.81)%、(58.80±0.49)%、(44.93±1.01)%、(95.26±2.19)%。2 mmol·L-1索拉非尼組、2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞遷移抑制率均高于對照組和大豆異黃酮組，差異有統計學意義(P<0.05 )；對照組與大豆異黃酮組細胞遷移率比較差異無統計學意義(P>0.05)；4 mmol·L-1索拉非尼組細胞遷移率顯著高于2 mmol·L-1索拉非尼組，4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞遷移率顯著高于2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組，差異有統計學意義(P<0.05)；2 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞遷移率顯著高于2 mmol·L-1索拉非尼組，4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞遷移率顯著高于4 mmol·L-1索拉非尼組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 對照組、大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞中VEGF-C mRNA和蛋白相對表達量比較結果見圖2和表1。4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞VEGF-C mRNA和蛋白相對表達量均低于對照組和大豆異黃酮單藥組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組與大豆異黃酮組細胞中VEGF-C mRNA和蛋白相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)；4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞VEGF-C mRNA和蛋白相對表達量低于4 mmol·L-1索拉非尼組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 對照組、大豆異黃酮組、4 mmol·L-1索拉非尼組、4 mmol·L-1索拉非尼+大豆異黃酮組細胞中VEGF-C mRNA和蛋白相對表達量比較

3 討論

據報道，我國每年約有11萬例新發病的宮頸癌患者，宮頸癌已成為全球女性致命的婦科惡性腫瘤之一[12-13]。腫瘤的存在、生長及轉移依賴于腫瘤細胞的增殖和腫瘤血管生成，抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤血管生成這2個環節可以達到治療腫瘤的目的[14]。目前，宮頸癌的治療方法主要有手術治療和放化療，晚期復發性宮頸癌的治療多使用化學治療配合手術和放射治療；而靶向治療、免疫治療及其聯合治療可用于復發或轉移宮頸癌的全身系統性治療。索拉非尼靶向作用于腫瘤細胞，可有力抑制原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶，且有較強的激酶選擇特性[5]。在新生血管形成及腫瘤進展中，索拉非尼對多種酪氨酸激酶受體有明顯抑制作用，包括血管內皮細胞生長因子受體2和3、血小板衍生生長因子受體、受體酪氨酸激酶等[15-16]。此外，索拉非尼可抑制細胞周期蛋白及細胞周期相關蛋白，如G1/S-特異性周期蛋白-D、細胞周期蛋白依賴性激酶 1[17]，使增殖期細胞不能通過“G1-S”調節點，阻滯在G1期從而阻斷細胞周期進展，進而影響細胞生長，促進凋亡[18]。研究報道，索拉非尼可以延長腫瘤患者的生存期，但其誘發的不良反應及耐藥限制了索拉非尼在臨床中的使用[19-20]。隨著現代藥理研究的推進和中藥提取技術的更新以及中藥有效成分對抗腫瘤作用機制研究的進一步加深，中藥因其毒副作用小、廉價等優勢在宮頸癌藥物治療方面展現出較大優勢，這為臨床宮頸癌抗癌藥物的研制和應用開拓了新方向[21]。研究表明，大豆異黃酮對乳腺癌[22]、前列腺癌[23]、皮膚癌[24]等均有較好的預防和治療作用。因此，推測大豆異黃酮和索拉非尼聯合治療宮頸癌有較好的效果。

本研究結果顯示，不同劑量索拉非尼組、不同劑量索拉非尼+大豆異黃酮尼聯合組細胞增殖抑制率均顯著高于對照組和大豆異黃酮組，細胞遷移抑制率顯著高于對照組和大豆異黃酮組；索拉菲尼組和索拉非尼+大豆異黃酮組隨著索拉菲尼濃度增高，細胞增殖抑制率顯著升高，細胞遷移抑制率顯著升高，遷移能力降低；且與對照劑量的索拉菲尼組相比，大豆異黃酮+索拉非尼聯合組細胞增殖抑制率均顯著升高，細胞遷移抑制率顯著升高，遷移能力顯著降低；說明大豆異黃酮可以協同索拉菲尼抑制Hela細胞的增殖和遷移，且與索拉菲尼呈劑量依賴性。

VEGF-C是近幾年新發現的腫瘤抑制因子，是一種經典的 Wnt 信號通路拮抗因子，作為一種抑癌基因參與宮頸癌的發生和發展過程。本研究結果顯示，索拉非尼組、大豆異黃酮+索拉非尼聯合組細胞中VEGF-C mRNA和蛋白相對表達量均顯著低于對照組和大豆異黃酮組；且在同一索拉非尼終濃度下，大豆異黃酮+索拉非尼聯合組細胞中VEGF-C mRNA和蛋白相對表達量均顯著低于索拉非尼組；說明索拉菲尼聯合大豆異黃酮可能是通過降低VEGF-C在Hela細胞中的表達，從而抑制Hela細胞的增殖和遷移。

綜上所述，大豆異黃酮聯合索拉菲尼對宮頸癌Hela細胞的增殖和遷移能力的抑制效果顯著優于單獨應用索拉菲尼，其機制可能是大豆異黃酮協同索拉非尼下調宮頸癌Hela細胞中VEGF-C mRNA和蛋白的表達。但是，本研究僅在體外細胞進行，今后需進一步進行小鼠體內實驗研究，進而為生物治療宮頸癌提供新思路和理論依據。