壺腹癌中B7-H1 和B7-H4的表達(dá)及與腫瘤T 淋巴細(xì)胞浸潤的關(guān)系

祁紫娟 吳鶴鳴 周照旭 姜虹

抗腫瘤免疫以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主。T細(xì)胞的活化需要TCR介導(dǎo)的抗原信號(hào)和協(xié)同刺激分子提供的第二信號(hào)共同作用[1]。B7-CD28家族是重要的協(xié)同刺激分子，其成員有些是激發(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，有些是下調(diào)或終止免疫應(yīng)答。B7-H1、B7-H4是B7-CD28家族新近發(fā)現(xiàn)的負(fù)性協(xié)同刺激分子，可通過抑制T細(xì)胞的活化和增殖來負(fù)調(diào)控T細(xì)胞的免疫應(yīng)答[2]，并已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織（如肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等）中異常表達(dá)，使人們注意到其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用，與腫瘤的免疫逃逸有關(guān)。但B7-H1、B7-H4在壺腹癌中的表達(dá)情況未有文獻(xiàn)報(bào)道。為對臨床下一步研究工作提供借鑒，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色，檢測壺腹癌中B7-H1、B7-H4的表達(dá)及其與腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

黑龍江省醫(yī)院2011年6月—2018年6月外科手術(shù)切除的壺腹癌標(biāo)本62例，其中18例正常組織來源于腫瘤組織的癌旁部分。試劑：鼠抗人B7-H1及B7-H4單克隆抗體來自博奧森生物技術(shù)有限公司。CD3，CD8，CD68及檢測試劑盒均來自北京中杉公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用PV-6000-G二步法。腫瘤組織標(biāo)本10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4μm 連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，階梯酒精內(nèi)水化；PBS液浸泡3次，每次5 min（3×5），浸于枸櫞酸鹽緩沖液1800 W高壓修復(fù)組織抗原1.5 min.，PBS沖洗3×5；3% H2O215分鐘阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3×5；除去PBS液，加入一抗4℃孵育過夜；PBS沖洗3×5，滴加通用型二抗孵育30 min，PBS洗滌; DAB顯色；蒸餾水沖洗；蘇木素復(fù)染；梯度乙醇脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3 染色結(jié)果評(píng)估

以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽性染色，在高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)腫瘤區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。B7-H1、B7-H4的染色強(qiáng)度根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比進(jìn)行半定量分級(jí)。結(jié)果判斷：＜20%為陰性；20%～100%為陽性。CD3+/ CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量為隨機(jī)選擇的5個(gè)癌視野在高倍鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究選擇 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所涉計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)表示方法及檢驗(yàn)方法分別為%和χ2檢驗(yàn)，而所涉計(jì)量數(shù)據(jù)表示方法和檢驗(yàn)方法分別為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差和t檢驗(yàn)，判定形成統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)為 P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 B7-H1、B7-H4在不同壺腹部組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，壺腹癌組織中B7-H1、B7-H4陽性染色定位在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜，呈彌漫性表達(dá)，大多數(shù)位于腫瘤實(shí)質(zhì)腺體上皮細(xì)胞，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞不表達(dá)兩者。在62例壺腹癌中，B7-H1表達(dá)的陽性率為80.65%（50/62）；B7-H4表達(dá)的陽性率為82.26%（51/62）；B7-H1和B7-H4雙陽性表達(dá)45例，占72.58%，雙陰性6例，占9.68%.B7-H1和B7-H4表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=0.809，P ＜0.01。癌旁正常壺腹部組織中，B7-H1、B7-H4表達(dá)較弱或不表達(dá)，陽性率分別為38.89%（7/18）和44.44%（8/18），與其在壺腹癌組織中表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.824，13.479，P＜0.01）。見表1。

2.2 B7-H1、B7-H4表達(dá)與腫瘤T細(xì)胞浸潤的關(guān)系

壺腹癌組織中CD3和CD8標(biāo)記的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞陽性定位于胞膜。CD3+T、CD8+T細(xì)胞呈圓形或橢圓形，大部分聚集在癌巢周邊的間質(zhì)，呈灶狀分布；少數(shù)可浸潤癌巢，直接與腫瘤細(xì)胞接觸。B7-H1陽性標(biāo)本的CD3+T、CD8+T細(xì)胞明顯低于B7-H1陰性標(biāo)本。B7-H1陽性表達(dá)與CD3+T數(shù)量呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.781，P＜0.01），與CD8+T無關(guān)（rs=0.046，P＞0.05）。B7-H4陽性中CD3+T、CD8+T低于B7-H4陰性中CD3+T。CD3+T、CD8+T數(shù)量與B7-H4陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.752，rs=-0.807；P＜0.01）。見表2，表3。

3 討論

壺腹癌是指生長于十二指腸乳頭及附近黏膜、壺腹內(nèi)黏膜、胰管開口及膽總管下段黏膜的惡性腫瘤[3]，免疫系統(tǒng)缺陷、宿主對腫瘤抗原缺乏反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)督是其發(fā)生和發(fā)展的重要因素。近年來，圍繞腫瘤的免疫逃逸機(jī)制做了多方面研究，介導(dǎo)T細(xì)胞共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的B7-CD28家族是其中的一個(gè)熱點(diǎn)，B7-H1和B7-H4是新近發(fā)現(xiàn)的B7家族成員，提供負(fù)性信號(hào)來限制、終止或削弱T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

B7-H1的受體是PD-1，B7-H1與其結(jié)合后發(fā)揮抑制效應(yīng)，抑制T細(xì)胞增殖活化、誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞發(fā)生凋亡、IL-2分泌，從而負(fù)性調(diào)控機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，參與腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[4]。B7-H4mRNA在腎、子宮、睪丸、肝、脾等多種人類組織上廣泛表達(dá)，蛋白水平上在人正常組織中卻未檢測到其表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，壺腹癌組織中B7-H1、B7-H4在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜呈彌漫性表達(dá)，大多數(shù)位于腫瘤實(shí)質(zhì)腺體上皮細(xì)胞，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞不表達(dá)兩者。其陽性率明顯高于癌旁正常壺腹部組織中B7-H1、B7-H4的陽性率（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合兩者在其他腫瘤組織中的文獻(xiàn)報(bào)道，提示B7-H1和B7-H4確實(shí)參與了壺腹癌的發(fā)生[5]。筆者認(rèn)為：在將來，需要進(jìn)一步收集組織標(biāo)本和患者的預(yù)后資料，來證實(shí)B7-H1和B7-H4共同表達(dá)的壺腹癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后的關(guān)系，有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

表1 B7-H1、B7-H4 在不同壺腹部組織中的表達(dá)（%）

表2 B7-H1 表達(dá)與腫瘤T 細(xì)胞浸潤的關(guān)系（個(gè)/μL）

表2 B7-H1 表達(dá)與腫瘤T 細(xì)胞浸潤的關(guān)系（個(gè)/μL）

B7-H1 表達(dá) CD3+T CD8+T陽性（50） 83.3±15.7 43.1±9.7陰性（12） 100.8±14.3 51.3±12.7 t 值 3.521 2.473 P 值 ＜0.01 ＜0.05

表3 B7-H4 表達(dá)與腫瘤T 細(xì)胞浸潤的關(guān)系（個(gè)/μL， ）

表3 B7-H4 表達(dá)與腫瘤T 細(xì)胞浸潤的關(guān)系（個(gè)/μL， ）

B7-H4 表達(dá) CD3+T CD8+T陽性（51） 81.5±12.9 41.4±8.5陰性（11） 110.9±11.3 59.8±6.5 t 值 6.992 6.749 P 值 ＜0.01 ＜0.01

為了了解壺腹癌中B7-H1和B7-H4表達(dá)與T淋巴細(xì)胞浸潤的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)專注檢測完全浸潤的T細(xì)胞數(shù)量作為其是否增殖的標(biāo)志[6]。盡管這種方法不能準(zhǔn)確說明T細(xì)胞是否活化的問題，但有理由相信，如果B7-H1和B7-H4發(fā)揮其負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答中抑制T細(xì)胞增殖的作用，會(huì)使組織中T細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。CD3檢測所有的T細(xì)胞的數(shù)量，CD8標(biāo)記CTL[7]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B7-H1、B7-H4陽性壺腹癌標(biāo)本中CD3+T、CD8+T細(xì)胞的數(shù)量明顯低于其陰性標(biāo)本，B7-H1陽性表達(dá)與CD3+T數(shù)量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；CD3+T、CD8+T數(shù)量與B7-H4陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。這些研究結(jié)果提示，B7-H1和B7-H4通過負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)督，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

癌組織內(nèi)浸潤的巨噬細(xì)胞為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）,可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制自然殺傷細(xì)胞（NK）和T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性，其浸潤數(shù)量與惡性腫瘤的某些生物學(xué)行為和預(yù)后密切相關(guān)[8]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[9-11]，卵巢癌組織中，TAM表面表達(dá)B7-H4，抑制T細(xì)胞免疫。而在本實(shí)驗(yàn)中，只觀察到少數(shù)的巨噬細(xì)胞胞質(zhì)B7-H4呈微弱表達(dá)而不是表達(dá)于細(xì)胞表面。這可能由于B7-H4被巨噬細(xì)胞的吞噬機(jī)制所吸收，而不是TAM本身表達(dá)B7-H4，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確定TAM的B7-H4來源。B7-H1和B7-H4表達(dá)情況與TAM數(shù)量的關(guān)系尚未有研究報(bào)道，具體作用機(jī)制也未闡明。B7- H1陽性、B7-H4陽性標(biāo)本癌細(xì)胞周圍的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，作為重要的炎癥反應(yīng)細(xì)胞TAM增多，抑制T細(xì)胞增殖，從而介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)。同時(shí)TAM也表達(dá)淋巴內(nèi)皮生長因子受體（VEGF-C）,通過刺激腫瘤淋巴管的形成促使腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[12]。

綜上所述，負(fù)性協(xié)同刺激分子B7-H1和B7-H4在壺腹癌組織中高表達(dá)，與T細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，參與壺腹癌細(xì)胞的免疫逃逸。