不同進(jìn)口藍(lán)耳病病原抗體ELISA檢測(cè)試劑盒比較及應(yīng)用淺析

李乃果 賈松濤

（1河南省滎陽(yáng)市畜牧局，河南滎陽(yáng) 450100；2河南省鄭州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450052）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起豬的一種高度接觸性傳染病，其主要特征是引起母豬繁殖障礙及仔豬呼吸道癥狀。1987年P(guān)RRS在北美首次暴發(fā)，1996年P(guān)RRS在我國(guó)大陸地區(qū)流行，2006年高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（Highly pathogenic PRRS,HP-PRRS）在我國(guó)暴發(fā)。近年來(lái)，PRRS類NADC30新毒株在我國(guó)流行，成為優(yōu)勢(shì)流行毒株之一。感染母豬主要表現(xiàn)為繁殖障礙，如發(fā)情不典型、受孕率低、流產(chǎn)、難產(chǎn)、木乃伊胎、弱仔及死胎等癥狀。患病仔豬主要表現(xiàn)出呼吸道疾病，咳喘、被毛粗亂、生長(zhǎng)緩慢及死亡率增加。PRRSV感染豬常導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，使機(jī)體易受環(huán)境和條件性病原的影響，伴隨其他疾病發(fā)生，如與豬支原體病、副豬嗜血桿菌病、豬流感及仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬呼吸道病綜合征等疾病混合感染、多重感染。PRRS是對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失的豬病之一。早期監(jiān)測(cè)和防控PRRS，對(duì)控制PRRS在豬場(chǎng)的穩(wěn)定尤為重要。

目前，市場(chǎng)上銷售的檢測(cè)PRRS抗體的試劑盒有多種，尤其是進(jìn)口試劑盒在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上有多個(gè)商業(yè)品牌，實(shí)驗(yàn)室或者養(yǎng)殖場(chǎng)在選擇檢測(cè)試劑盒的時(shí)候往往無(wú)所適從。

筆者選購(gòu)了市場(chǎng)上占有率較高的4種PRRS抗體檢測(cè)試劑盒，并篩選出其中1種敏感度較高、符合豬場(chǎng)臨床生產(chǎn)要求的試劑盒，以期為其他實(shí)驗(yàn)室或者養(yǎng)殖場(chǎng)科學(xué)合理選擇PRRS抗體檢測(cè)試劑盒提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

PRRS病原陰/陽(yáng)性血清，由河南天馳生物科技公司提供。

選擇4種進(jìn)口PRRS抗體檢測(cè)試劑盒，分別由I、J、B、L公司生產(chǎn)。

一次性1.5 mL離心管、精密微量移液器（50～1 000μL）、移液滴頭、微量振蕩器、酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、隔水式培養(yǎng)箱等實(shí)驗(yàn)器材。

1.2 檢驗(yàn)方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)于每份待檢血清，分別用上述4種進(jìn)口PRRS抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，分析其符合率，以此比較各方法差異。檢測(cè)及結(jié)果判定均按照說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。

I廠家試劑盒以核衣殼蛋白為包被抗原，可以檢測(cè)EU/US毒株抗體，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是S/P值（樣品OD值/陽(yáng)性對(duì)照平均OD值）≥0.4為陽(yáng)性，S/P值＜0.4為陰性。J廠家試劑盒以核衣殼蛋白為包被抗原，只能檢測(cè)US毒株抗體，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是S/P值≥0.4為陽(yáng)性，S/P值＜0.3為陰性，S/P值介于0.3～0.4之間為可疑。B廠家試劑盒以滅活PRRS EU/US病毒為包被抗原，只能檢測(cè)EU或者US毒株抗體，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是S/P值≥0.4為陽(yáng)性，S/P值≤0.399為陰性。L廠家試劑盒包被的是膜蛋白（M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5），只能檢測(cè)US毒株抗體，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是IRPC 值 ﹝（樣品OD值-陰性對(duì)照平均OD值）/（陽(yáng)性對(duì)照平均OD值-陰性對(duì)照平均OD 值）﹞ ＞20為陽(yáng)性，IRPC值≤20為陰性。

2 檢驗(yàn)結(jié)果

2.1 檢測(cè)陽(yáng)性樣品的試劑盒敏感性比較

取1份已知為PRRSV陽(yáng)性的樣品，該樣品為PRRS美洲株免疫的高免血清，將陽(yáng)性樣品用相應(yīng)的樣品稀釋液進(jìn)行 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍比稀釋，評(píng)估I、J、B、L不同廠家試劑盒的檢測(cè)敏感性。結(jié)果表明，I廠家試劑盒在樣品進(jìn)行10-4稀釋后仍然可以檢測(cè)到抗體，J和B廠家試劑盒在樣品稀釋后檢測(cè)不到抗體，因此，I廠家的敏感性最好（見(jiàn)表1）。

2.2 檢測(cè)免疫過(guò)PRRS疫苗的血清樣品的試劑盒敏感性比較

取2份已免疫過(guò)PRRS疫苗（免疫疫苗為高致病性藍(lán)耳病凍干活疫苗，天津株）的血清樣品，分別標(biāo)記為血清樣品1、血清樣品2，將待檢樣品用相應(yīng)的樣品稀釋液進(jìn)行 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍比稀釋，按照各試劑盒操作要求，檢測(cè)血清中的抗體水平，評(píng)估不同廠家試劑盒的檢測(cè)敏感性。結(jié)果顯示，I廠家的試劑盒在血清樣品1和血清樣品2分別稀釋10-6和10-7后，仍然可以檢測(cè)到樣品抗體陽(yáng)性；J廠家的試劑盒在血清樣品1和血清樣品2分別稀釋10-2和10-3后，可以檢測(cè)到樣品抗體陽(yáng)性；B廠家的試劑盒在血清樣品1和血清樣品2分別稀釋10-2和10-4后，可以檢測(cè)到樣品抗體陽(yáng)性；L廠家的試劑盒在血清樣品1和血清樣品2均是稀釋10-4后，可以檢測(cè)到樣品抗體陽(yáng)性；從稀釋倍數(shù)數(shù)據(jù)比較說(shuō)明I廠家的試劑盒敏感性最好，J、B、L三個(gè)廠家敏感性相當(dāng)（表2）。

3 應(yīng)用PRRS抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)建立豬場(chǎng)PRRS抗體基準(zhǔn)線

各養(yǎng)豬企業(yè)可以基于長(zhǎng)時(shí)間的PRRS抗體水平檢測(cè)數(shù)據(jù)積累和處理經(jīng)驗(yàn)建立本企業(yè)的PRRS抗體水平基準(zhǔn)線，也就是所謂的“baseline values”。基準(zhǔn)線的建立是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，一旦建立了屬于本場(chǎng)的生產(chǎn)基準(zhǔn)線，便可快速評(píng)估免疫程序是否合理，有效分析日常檢測(cè)數(shù)據(jù)，增強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果的生產(chǎn)指導(dǎo)意義，避免經(jīng)驗(yàn)主義，及時(shí)判斷整個(gè)豬群有無(wú)潛在的安全隱患。

如果檢測(cè)數(shù)據(jù)偏離基準(zhǔn)線，則提示生產(chǎn)環(huán)境中發(fā)生了某些改變，如感染疾病、免疫失敗等。如果檢測(cè)的抗體滴度值遠(yuǎn)高于正常的抗體水平，則提示存在野毒感染的可能性；如果檢測(cè)的抗體滴度值低于預(yù)期的疫苗免疫應(yīng)答滴度，則表明免疫程序不合理或者疫苗質(zhì)量有問(wèn)題。但每個(gè)豬場(chǎng)的基準(zhǔn)線并不一樣，應(yīng)該結(jié)合本場(chǎng)的實(shí)際情況綜合判斷。

基于大量的PRRS抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)并結(jié)合多數(shù)豬場(chǎng)的飼養(yǎng)管理狀況，總體出PRRS抗體與豬場(chǎng)生產(chǎn)性能存在相關(guān)性：①高性能生產(chǎn)水平、健康且持續(xù)穩(wěn)定的豬場(chǎng)，符合S/P值≥2.0的個(gè)體占整個(gè)群體的比例≤10%，S/P值≥2.5的個(gè)體出現(xiàn)比率低（≤5%）或不出現(xiàn)，種豬群體S/P值介于0.4～1.5之間，群體占比80%～90%；②中等偏上水平、健康穩(wěn)定且偶有波動(dòng)的豬場(chǎng)，S/P值≥2.0的個(gè)體占整個(gè)群體的比例≤20%，S/P值≥2.5的個(gè)體占整個(gè)群體的比例≤10%，S/P值≥3.0的個(gè)體不出現(xiàn)或很少出現(xiàn)（≤5%），種豬群體S/P值介于0.4～1.5之間，占70%～80%；③中等性能水平、季度性出現(xiàn)波動(dòng)的豬場(chǎng)，S/P值≥2.0的個(gè)體占整個(gè)群體的比例在20%～30%。

表1 陽(yáng)性樣品試劑盒敏感性檢測(cè)結(jié)果

表2 免疫過(guò)PRRS疫苗的血清樣品的試劑盒敏感性檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論與分析

⑴通過(guò)檢測(cè)PRRS抗體水平建立抗體水平基準(zhǔn)線并在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用是一項(xiàng)積極的探索，并且可以推廣至其他疫病的監(jiān)測(cè)上。

⑵通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)的檢測(cè)并對(duì)照建立抗體水平基準(zhǔn)線，能夠及早發(fā)現(xiàn)某種疫病免疫程序中可能存在的問(wèn)題，可以為豬場(chǎng)提供風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警，便于查找風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)并及時(shí)進(jìn)行防控。

⑶豬場(chǎng)PRRS抗體的水平與其保護(hù)力不是正相關(guān)的關(guān)系，檢測(cè)的PRRS抗體陽(yáng)性率并不能代表對(duì)PRRS的保護(hù)力。目前的抗體檢測(cè)方法不能區(qū)分PRRSV流行毒株感染產(chǎn)生的抗體和疫苗免疫產(chǎn)生的抗體；檢測(cè)的抗體水平一般都是總抗體水平，不代表中和抗體水平。但是抗體陽(yáng)性率和平均值，可以反映PRRS的穩(wěn)定狀態(tài)，個(gè)體動(dòng)物或者整個(gè)豬群的S/P值的走勢(shì)能夠反映PRRS感染所處的階段，可用于分析疾病處于感染初期還是轉(zhuǎn)歸階段。