1例斑駁病大家系臨床表型及基因突變研究

葛宏松，李 越，張 成，漏 瓊，李 明

斑駁病的最具特征的臨床表現是額部、發際部呈三角形或菱形白斑，常伴有橫跨發際的白色額發；此外白斑常見于上胸、腹部及四肢，偶見于面部、手足、背部等部位。白斑出生后即發生，終生穩定存在，部分患者的白斑周邊、甚至中央可以出現不同程度和大小的色素沉著斑[1]。組織病理學顯示，白斑部位黑素細胞完全缺失。臨床上表現各異，盡管是同一個家系成員，其臨床表現也不完全相同。斑駁病是一種罕見的常染色體顯性遺傳性皮膚病，由于黑素細胞先天性發育不良導致的色素脫失性疾病[2]。位于人類染色體4q12上的編碼肥大/干細胞因子(stem cell actor, SCF)細胞表面跨膜受體KIT的基因突變(也稱c-kit或CDll7基因)，導致胚胎發育期黑素母細胞的增殖、分化和遷移發生障礙,從而引起斑駁病的發生[3]。到目前為止在斑駁病中，已有70多個KIT基因突變被報道[2-7]。該研究報道1例斑駁病大家系中存在新的KIT基因突變位點及外顯不全表現。

1 材料與方法

1.1 家系情況1家3代14位成員，其中患者4例，見家系圖1。先證者(Ⅲ：2)，男，2月，父母非近親結婚。查體：一般情況良好，發育正常。皮膚科專科檢查：先證者出生時即發現前額可見菱形分布的白斑橫跨發際線，白斑處頭發為白發，前胸、腹部、四肢可見彌漫性分布且相互融合的大片狀脫色素斑，部分白斑周邊可見數個類圓形錢幣大小的淡褐色色素沉著斑，面積超過50%。此外，左小腹部可見深褐色咖啡斑。家系其他成員調查：先證者外公及大姨前額、雙小腿有大面積界限清晰的白斑，部分白斑內可見少許散在的色素斑，先證者姐姐雙小腿有大面積界限清晰的白斑，先證者母親未見明顯皮損；Wood燈下可見大片狀界清的脫色素白斑，同時白斑區內可見彌漫分布、程度不均的類圓形色素沉著斑。見圖2。

圖1 家系圖

1.2 外周血基因組DNA提取研究遵照赫爾辛基宣言，并由安徽省兒童醫院倫理委員會審查通過。在征得所有患者以及正常人的知情同意后，采集所有家系成員及100例與本家系無關正常人的外周靜脈血3 ml。用DNA提取試劑盒(購自美國普羅米加公司)提取基因組DNA。

圖2 典型病例的臨床表現

圖3 KIT基因突變圖

1.3 PCR擴增在線查取KIT基因mRNA序列經BLAST比對得到KIT基因的基因組序列(http://www.genome.UCSC.edu/)，應用Primer3.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.O/primer3/)在線平臺設計針對KIT基因全部編碼外顯子的特異性引物進行PCR擴增，包括外顯子及內含子交界50 bp的序列。采用25 μl的反應體系：10x緩沖液2.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，50 pmol/L雙向引物混合物0.5 μl，TaqDNA聚合酶1.0 U，DNA模板1.0 μl (20 ng)，加雙蒸水至25 μl。PCR擴增程序如下：5 min升溫至94 ℃，并在94 ℃變性持續30 s，于55～60 ℃退火，持續30 s，于72 ℃延伸，持續45 s，共38個循環，72 ℃終極延伸45 s。所有PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證。

1.4 DNA直接測序PCR產物送上海安百隆生物技術服務有限公司進行正向測序，測序結果與人類基因組KIT基因序列比較，如發現突變再行反向測序進行驗證。

2 結果

成功擴增了KIT基因內所有外顯子以及外顯子與內含子交界區的基因序列。先證者的測序結果顯示KIT基因外顯子內第272位堿基A突變為T(c.272A>T)；在家系內另3例患者及家系中正常成員先證者母親也都檢測到了該突變，而在家系中其他正常成員及100名正常對照經測序均未發現以上兩個突變，因此排除了以上堿基改變為單核苷酸多態性的可能。見圖3。

3 討論

目前研究表明，斑駁病主要是由編碼SCF受體的KIT基因突變引起，該突變導致受體功能的部分缺失[1]。人類KIT基因組位于4號染色體長臂區(4q12)，DNA全長大約89 kb，包括21個外顯子。SCF受體是一種受體酪氨酸激酶，斑駁病患者的KIT基因發生突變后，SCF受體功能下降，從而影響其介導的多條信號分子通路，進一步抑制胚胎期的成黑素細胞的增殖，導致胎兒出生后的色素形成異常，引起斑駁病。

目前被檢測出KIT基因的突變類型有：點突變、不同位點發生堿基缺失或缺失、核苷酸剪接位點突變等，以上所有基因突變的結果均可導致KIT受體功能不同程度的改變，從而造成酪氨酸激酶功能的部分喪失或缺失，引起斑駁病特有臨床癥狀的發生。迄今報道KIT基因突變約有70多種，大多數為無義或錯義突變，其次是該基因的剪切位點突變。研究發現斑駁病臨床表型的輕重與KIT基因突變的不同位點密切相關，KIT基因突變對SCF/KIT信號傳導途徑功能損害越大，其臨床表型越嚴重。

近年來，國內外相繼報道了一些KIT基因的錯義突變，即c.1861G>A、c.1872G>A、c.860T>A、c.1861G>A和c.2017T>G等[2-7]。本例家系于第91位密碼子出現錯義突變c.272A>T(p.Asn91Ile)，即屬于此種突變，家系中患者之間顯示出了較大的表型變異，其中最為嚴重的是先證者，先證者、家系內另3例患者及家系中正常成員先證者母親也都檢測到了KIT基因外顯子內第272位堿基A突變為T(c.272A>T)存在該突變，此突變位點經文獻檢索未發現有類似報道。該家系中先證者母親攜帶該突變，但目前為止未發現皮膚及毛發色素異常，可能為外顯不全，原因可能在于除了KIT基因之外，可能存在其他調控基因影響疾病的發生，當然先證者的母親隨著隨訪的時間延長，也會出現輕癥的臨床表現。KIT基因該位點的突變致病分子機制值得我們進一步研究。