手術聯合細胞治療皮膚型黑色素瘤的療效觀察

張啟婷，趙 華，李文明，曹曉卉，賈紹昌

黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一種因黑色素細胞病理性增生導致的惡性腫瘤，早期便可發生轉移，具有惡性程度高，術后復發率高，死亡率高等特點[1]。局部增生或原位癌等早期MM患者，通過手術治療可得到痊愈，但許多患者早期未予重視，常發展到中晚期，特別是發生轉移的患者，則很難治愈，術后復發率極高。其中位生存期僅8～9月，三年生存率僅10%～15%，5年生存率少于10%[2]。MM常規治療方案首選手術治療，輔助放化療，但MM對放化療敏感性極低[3]。近年來隨著人類對腫瘤免疫認識的提高，腫瘤的免疫治療有了迅速的發展，同時免疫治療也成為腫瘤治療領域的熱門領域，成為人類攻克惡性腫瘤的新希望。MM為目前研究的對免疫治療敏感性較強的一種，因而成為國內外學者在免疫治療方面的主要研究對象[4]。課題組之前針對樹突狀細胞(dendritic cell，DC)聯合細胞因子誘導的殺傷(cytokine-induced killer，CIK)細胞對MM患者的免疫療效已有報道[5]。該研究收集手術治療聯合DC-CIK細胞療法的患者及單獨使用手術治療的患者，回顧性分析兩者產生臨床收益的差別。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取于2008年6月～2018年6月在中國人民解放軍第八一醫院住院治療的59例皮膚型MM患者。患者年齡24～88歲，中位年齡60歲，其中32例接受手術聯合DC-CIK細胞治療，27例接受手術治療。兩組患者病例資料差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。病例納入標準：① 經病理學確診為黑色素細胞瘤，并且原發灶位于皮膚；② 治療組患者經過至少2次及以上的DC-CIK細胞治療，并且未接受其他輔助治療；③ 對照組患者經過手術治療僅輔以姑息治療；④ 卡氏(karnofsky，KPS)功能狀態評分標準評分≥60分，預計生存期不少于3個月；⑤ 心、肝、腎等主要臟器無明顯功能異常。治療組病例排除標準：① 懷孕或哺乳期女性；② 年齡≤18周歲；③ 有嚴重感染性疾病、自身免疫病或器官衰竭者；④ 對生物制劑過敏者。患者不同病情、性別及年齡比例差異無統計學意義(P>0.05)，比較具有合理性。本研究經本院倫理委員會審核同意，由患者或其家屬知情并簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1主要儀器與試劑 COM.TE血細胞分離機購自德國Fresenius公司；Beckman Coulter XL流式細胞儀購自美國Beckman 公司；eppendorf Centrifuge 5810 R離心機購自德國eppendorf公司；Ficoll淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限公司；抗CD3單克隆抗體購自北京寶日醫生物技術有限公司；KBM-581、KBM-551培養基、臨床使用標準品rhG-CSF均購自康寧生命科學有限公司；臨床使用標準品重組人白介素-2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)購自北京四環生物制藥有限公司；重組人干擾素(recombinant human interferon，rhIFN-γ)購自上海生物醫藥有限公司；重組人白介素-4(recombinant human interleukin-4，rhIL-4)、重組人腫瘤壞死因子(recombinant human tumor necrosis factor-α，rhTNF-α)均購自美國Peprotech 公司；流式抗體CD3-ECD、CD4-PC5、CD8-FITC、CD86-PC5、CD11c-PE、HLA-DR-ECD、CD83-FITC、CD80-FITC、CD54-PC5、CD4-FITC、CD3-PC5、CD8-PE、CD25-PE、CD16+CD56-PE均購自美國Beckman公司。

表1 兩組患者臨床資料比較(n=59)

1.2.2治療 按照《中國黑色素瘤診療指南》[3]，手術視原發灶部位選擇麻醉方式，沿原發病灶邊緣1～3 cm范圍完整切除病灶，切除深度至深筋膜深面，伴有淋巴結轉移者做區域淋巴結清掃，伴轉移灶者可做轉移灶切除術。術后對照組輔以對癥姑息治療，治療組予以DC-CIK細胞治療，DC疫苗于第7天開始每隔一周分4次于皮下六點注射(雙側鎖骨下、雙側腋窩下、雙側腹股溝淋巴結引流區)，回輸量約1.0×107～4×107/次，CIK細胞于9～21 d內視情況分3次輸完，回輸量約1.0×109～3×109/次。每個療程間隔3個月。

1.2.3DC-CIK細胞及DC疫苗的制備 運用血細胞分離機采取患者自體血60 ml，置于50 ml離心管，離心分離出血漿，56 ℃水浴滅活用于后期細胞培養。血細胞用生理鹽水稀釋，加入淋巴細胞分離液，密度梯度離心，吸取白膜層即外周血單個核細胞層，用KBM-551培養基調整細胞密度為(2×106～3×106) /ml,鋪于細胞培養瓶中，孵育1～2 h，移出上層培養液留于CIK細胞的培養。向培養瓶中加入含rhIL-4 10 ng/ml和重組人粒細胞刺激因子注射液(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)500 U/ml的KBM-581培養基，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，隔天換液，第5天加入抗原致敏，第6天加入rhTNF-α 500 U/ml,第7天回收DC細胞，制成細胞懸液，回輸前進行細菌、真菌、內毒素檢測，并用流式細胞儀檢測DC細胞表型(HLA-DR+、CD11c+、CD54+、CD80+、CD83+、CD86+)。CIK細胞的制備：將之前收集的懸浮細胞用KBM-551培養基，調整細胞數目為1×106/ml，添加rhIFN-γ 1 000 U/ml，24 h后rhIL-2 500 U/ml、antiCD3 mAb 50 ng/ml，隔天補液，并添加400 U/ml rhIL-2,視細胞狀態及數量于細胞培養第9～21天內將細胞分3次回收輸入患者體內，回輸前進行細菌、真菌、內毒素檢測，流式檢測CIK細胞表型(CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+，主要為CD3+CD56+)。

1.3 評價方法

1.3.1隨訪 對每位患者進行隨訪，最長隨訪時間為89個月。從治療開始到死亡或至隨訪截至日期計算總生存期(overall survival,OS)，從治療開始至疾病進展計算無進展生存期(progression-free survival,PFS)。

1.3.2免疫功能 分別于治療前及治療后兩個月內抽取患者外周血，流式細胞術檢測患者外周血T淋巴細胞亞群的分布情況，主要指標為CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD4+CD25+。

1.3.3療效觀察 ① 治療期間密切觀察患者癥狀、體征，注意是否發生不良反應，并記錄其表現、發生時間、處理方法及轉歸(不良反應評級按照美國國立癌癥研究所《常見不良反應標準》進行評估。② 治療后1個月復查血常規、肝功能，3個月復查胸腹部X線計算機斷層攝影(computed tomography, CT)，了解有無復發，病情穩定可延長至3～6個月復查。③ 密切觀察患者治療前后精神狀態、睡眠及進食情況；觀察治療前后生活質量變化，采用KPS功能狀態評分標準，以治療后KPS增加≥10分為生活質量改善，變化<10分為生活質量穩定，減少≥10分為生活質量降低，以生活質量改善為有效，穩定及降低為無效。

2 結果

2.1 DC-CIK細胞鑒定DC細胞培養后伸出突觸，并隨培養時間的增長，觸角增多增長，第7天流式檢測成熟DC細胞表面標志，HLA-DR、CD54、CD80、CD83、CD86大于90%；CIK細胞培養后細胞變大，聚集成團，第10天流式檢測CIK細胞，效應型細胞CD3+CD8+、CD3+CD56+數量明顯增多。見圖1。

圖1 DC-CIK細胞培養前后變化 ×400

A：DC細胞培養前后照片；B：CIK細胞培養前后照片；1：培養前；2：培養后

2.2 兩組OS及PFS比較治療組32例，死亡15例，中位OS為49個月，中位PFS為19.5個月，1年生存率84.4%，3年生存率62.5%，5年生存率37.5%；對照組27例，死亡17例，中位OS為27個月，中位PFS為13個月；1年生存率77.8%，3年生存率29.6%，5年生存率14.8%；χ2檢驗結果顯示，治療組生存率優于對照組，其中3年生存率差異有統計意義(P=0.012)，見表2；Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank test檢驗結果顯示，兩組患者OS比較，治療組患者OS優于對照組患者，差異有統計學意義(P=0.028 7)，兩組患者PFS比較，差異無統計學意義(P=0.165 0)。見圖2。

表2 兩組患者生存率比較[n(%)]

2.3 兩組患者治療前后免疫功能變化比較對兩組患者治療前后進行淋巴細胞亞群檢測，結果顯示：對照組CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD3-CD56+細胞亞群比例無明顯變化(P>0.05)；治療組總T淋巴細胞比例較治療前增高，差異有統計意義(P=0.0316)，細胞毒性T淋巴細胞較治療前明顯上升(P=0.0088)，抑制性T淋巴細胞較治療前下降，差異有統計學意義(P=0.0040)，余無明顯變化。見表3。舉1例治療組患者淋巴細胞亞群為例，可見CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD56+增高，CD4+CD25+、CD3+CD8+明顯降低。見圖3。

圖2 兩組患者OS及PFS曲線

A：兩組患者OS曲線比較；B：兩組患者PFS曲線比較

表3 兩組患者治療前后外周血T淋巴細胞亞群變化情況比較

圖3 治療組1例患者治療前后的淋巴細胞亞群圖

A：細胞治療前；B：細胞治療后；1：CD3+流式圖；2：CD3+CD4+流式圖；3：CD3+CD8+流式圖；4：CD4+CD25+流式圖；5：CD3-CD56+流式圖

2.4 兩組患者治療前后生活質量改變比較治療組中有效22例，無效10例；對照組中有效11例，無效16例，Kruskal-Wallis H檢驗顯示治療組的生活質量改善情況優于對照組，差異有統計意義(P=0.025)。見表4。

表4 兩組患者治療前后生活質量改變情況比較(n)

3 討論

MM是皮膚癌中最常見的類型，近年來已成為增長最快的腫瘤之一，數據顯示2012年MM新增病例數為232 000，死亡例數為55 000，嚴重影響全球居民健康[6]。研究[7]表明，當腫瘤負荷<1×106時，免疫治療可能取得較好的療效。因此先用手術方式減輕腫瘤負荷，再輔以免疫治療清除微小病灶，并提高自身免疫力以增強機體抗腫瘤免疫，是一種很有希望的聯合治療方式。

DC細胞是目前已知最強的抗原提呈細胞，未成熟DC在抗原刺激后發育成成熟DC，成熟DC可將抗原呈遞給T細胞并能分泌細胞因子進一步促進免疫應答。臨床上利用DC治療腫瘤，主要通過體外用特異性腫瘤抗原刺激未成熟DC細胞，DC細胞識別并攝取抗原，發育成具有特異性抗原提呈功能的成熟DC細胞[8]。CIK細胞是由外周血單個核細胞經有序的細胞因子體系誘導后獲得的新型的具有免疫效應的細胞群，其兼具自然殺傷細胞的非限制性殺傷特點和T細胞的強抗腫瘤活性[9]。DC和CIK細胞均為腫瘤免疫方面重要的成員，兩者具有協同作用，負載特異性腫瘤抗原的DC細胞可介導CIK細胞產生特異性抗腫瘤免疫反應[10]。許多研究[11]表明DC疫苗聯合CIK治療比單獨使用DC或CIK更有效果。

本研究用特異性多肽組合負載DC細胞制備MM特異性DC疫苗，采用淋巴結區皮下注射(培養后第7天開始回輸第1次，每次隔1周，分4次輸完)，CIK細胞于靜脈回輸(培養后第9～21天分3次回輸完)，以保證CIK細胞對MM的特異性殺傷。治療時機選擇上，治療組均在手術切除原發灶后進行，細胞治療療程不小于2個療程，對照組為單純行手術治療，術后予對癥治療。比較兩組患者在生存期、生活質量及免疫功能等方面的變化。

結果顯示，治療組和對照組中位OS分別為49個月及27個月，中位PFS分別為19.5個月及13個月，1年生存率分別為84.4%及77.8%，3年生存率62.5%及29.6%，5年生存率37.5%及14.8%；統計學分析顯示治療組OS及3年生存率優于對照組，差異有統計學意義，其余指標差異無統計學意義；該結果提示DC-CIK細胞治療雖未延長患者術后PFS，但可延長MM患者術后OS，可能提高患者的遠期生存率，這與Zhang et al[10]關于DC-CIK細胞運用于肝動脈灌注化療栓塞術后肝癌患者的研究結果一致。兩組患者淋巴細胞亞群比較，治療后治療組患者T細胞比例有明顯升高，抑制性T細胞較前下降，CD8+T細胞較前上升，而對照組患者僅CD8+T細胞上升，余無明顯變化；抗腫瘤免疫中T細胞介導的細胞免疫是最重要的成員，其數量一定程度反映機體的免疫功能，其中調節性T細胞(regulatory cells, Treg)是一類免疫調節細胞，其可通過抑制機體免疫反應促進腫瘤發生、發展，與腫瘤患者預后緊密相關[12]。CD8+T細胞為效應型細胞，一般認為其為抑制性T細胞，含量越高，抑制性越強，免疫功能越弱[13]。但也有文獻[14]報道效應型CD8+T與多種腫瘤的預后成正相關。治療組患者治療后總T淋巴細胞上升、Treg細胞比例下降，CD8+T淋巴細胞上升，而對照組僅CD8+T細胞較前上升，提示DC-CIK可以提高患者的免疫功能，這可能是DC-CIK延長患者生存期的原因之一。此外DC-CIK細胞治療還可提高患者質量，其較單純行手術治療的患者有明顯優勢，差異有統計學意義。這與劉洋 等[15]關于DC-CIK聯合化療治療MM的研究結果一致。

綜上所述，DC-CIK細胞免疫治療是一種安全有效的腫瘤治療方式，本研究為進一步探討免疫治療提供了可靠的評估依據，但本研究并未探索其作用機制，后期可檢測樣本細胞因子、凋亡相關蛋白等的變化，進一步深入驗證。