賽 愷，余昌俊

直腸癌(rectal cancer, RC)是常見的惡性消化道腫瘤，當前根治性手術仍然是其主要的治療方法，但仍有40%～50%的患者因術后復發或轉移而死亡[1]。尋找預測預后的有效生物學指標是當下RC診療的研究熱點。轉錄因子(nuclear factor-erythroid 2，NF-E2)相關因子3(NF-E2-related factor 3，NFE2L3，又稱Nrf3)是NF-E2家族的第三個家族成員，主要的生物學作用是誘導抗氧化作用基因的表達[2]。近期有研究表明[3-5]，NFE2L3在血液系統、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈顯著高表達，且與患者預后有著密切關系，但NFE2L3在RC中的表達及預后意義目前仍未見明確報道。該研究利用免疫組化驗證結合生物信息學預測的方法探討NFE2L3在RC中的表達水平及其與臨床預后指標的相關性。

1 材料與方法

1.1 生物信息學預測選擇癌癥相關數據庫(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)[6]和Oncomine[7]進行生物信息學預測，具體實施步驟如下：輸入基因名稱“NFE2L3”和癌癥類型中選擇“直腸腺癌”檢索分析NFE2L3基因mRNA的相對表達水平，按其表達水平高低降序排列，排名前50%定義為NFE2L3高表達(46例)，余下定義為NFE2L3低表達(46例)。運用Kaplan-Meier法繪制“NFE2L3基因表達水平-患者的總生存期(overall survival，OS)關聯曲線。

1.2 RC標本及患者相關臨床信息回顧性收集2008年4月～2016年12月在安徽醫科大學第一附屬醫院普外科的RC患者癌、配對癌旁組織石蠟標本66對，術后病理均證實直腸腺癌。患者相關的臨床信息見表2。本研究已經安徽醫科大學倫理委員會審批，所有患者已簽署知情同意書。

1.3 免疫組化及結果判讀相關標本應用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin-perosidade，SP)對進行檢測。一抗為NFE2L3兔多克隆抗體(貨號：HPA055889)購自美國Sigma公司，工作濃度為1∶200。染色結果：利用盲法測定，兩名病理醫師對每一張切片進行獨立判斷，參照此前已報道的判讀方法[8]，根據染色陽性細胞數(percentage of positive cells，PP)乘以染色強度(staining intensity，SI)的百分比計算免疫反應性評分(immunoreactive score，IRS)，評分標準為：SI(0～3分)：0為陰性，1為弱陽性，2為中度陽性，3為強陽性；PP(0～4分)：0為陰性，1為1%～25%，2為26%～50%，3為51%～75%，4為76%～100%。結合IRS評分范圍為0 ～12分，若IRS> 4分，定義為NFE2L3高表達；若IRS≤4分，評為NFE2L3低表達。

1.4 統計學處理采用SPSS19.0軟件進行統計分析。RC與正常對照組之間陽性表達率的比較采用χ2檢驗。Kaplan-Meier法(log-rank test)進行單因素生存分析，而后將在單因素生存分析有意義的因素代入進行Cox多因素生存分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NFE2L3在RC中呈顯著高表達GEPIA數據庫中共檢索到含有NFE2L3基因表達信息的RC 92例，正常對照318例見圖1A；其中共有5項關于“直腸癌vs正常對照組”的研究在Oncomine數據庫中檢索到，該研究涉及到有NFE2L3基因表達水平的信息見圖1B，結果均顯示：與正常對照組比較，NFE2L3基因mRNA在RC中呈現顯著高表達，差異有統計學意義(P均<0.05)。經免疫組化SP法進一步驗證上述結果顯示，NFE2L3蛋白主要表達于RC細胞核中，在RC中表達呈現高表達(66.7%)顯著低于配對癌旁正常組織(15.2%)，見圖2，差異有統計學意義(P<0.001)，見表1。此蛋白表達結果與利用癌癥相關數據庫預測的mRNA表達結果相一致。

表1 NFE2L3在RC及配對癌旁組織中的蛋白表達水平

2.2 NFE2L3表達與RC患者臨床病理參數的關系隨后，對RC中NFE2L3差異表達水平與患者的各項臨床病理參數的關系進行檢測，見表2。 NFE2L3的差異表達水平僅與有無脈管侵犯有關，差異有統計學意義(P=0.013)，而與患者性別、年齡、有無淋巴結侵犯、組織學分級、腫瘤大小、TNM分期及浸潤深度無關。

表2 NFE2L3差異表達水平與RC患者各臨床病理參數的關系

圖1 癌癥相關數據庫預測NFE2L3基因在RC中高表達A：GEPIA數據庫預測結果；B：Oncomine數據庫預測結果；與正常對照組比較：*P<0.05

圖2 免疫組化法檢測NFE2L3在RC及癌旁正常組織的蛋白表達水平 SP×100

A：NFE2L3在癌旁正常組織中低表達；B：NFE2L3在RC組織中高表達

2.3 NFE2L3預測RC患者臨床預后的價值隨后對RC患者的預后與NFE2L3基因的差異表達水平的關系進行研究。GEPIA數據庫預測顯示：RC患者中NFE2L3基因mRNA高表達者的預后顯著好于其低表達患者(P=0.041)，見圖3A，經進一步免疫組化SP法檢測得到相似的結論，RC患者中NFE2L3蛋白高表達者的總生存時間顯著好于其低表達者，差異有統計學意義(P=0.009)，見圖3B；Kaplan-Meier單因素生存分析結果示：NFE2L3差異表達水平、脈管侵犯、TNM分期及浸潤深度是決定RC患者總生存時間差異的關鍵因素，見表3；將該4個單因素代入Cox多因素生存分析后，顯示如下：NFE2L3表達水平可作為RC患者預后的獨立預測因子(P=0.012)。見表4。

表3 RC患者的Kaplan-Meier單因素生存分析

圖3 基于NFE2L3表達水平差異繪制總生存曲線

A：NFE2L3 mRNA表達水平與總生存期曲線(Kaplan-Meier法)；B：NFE2L3蛋白表達水平與總生存曲線(Kaplan-Meier法)

表4 RC患者的Cox多因素生存分析值

3 討論

目前在霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、大腸癌、睪丸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均發現NFE2L3呈現顯著高表達水平[3-5, 9-10]，但有關該基因到底扮演著促癌基因還是抑癌基因的角色卻存在著不同的研究發現。Chevillard et al[11]最早利用NFE2L3基因缺陷的小鼠模型發現，該基因缺失后的小鼠對致癌物苯并芘的敏感性高度增加，其T細胞淋巴母細胞淋巴瘤的發病率顯著升高，且死亡率亦增加，提示該轉錄因子在造血系統惡性腫瘤中具有保護作用，發揮著抑癌基因的角色。另一方面，Wang et al[10]證實NFE2L3在胰腺癌中呈明顯高表達，并與患者淋巴結轉移及TNM分期呈正相關性，且高表達NFE2L3的患者生存期更短，其機制與其調控血管內皮生長因子A表達促進腫瘤血管生成有關，該結果提示NFE2L3又具有促癌基因的角色。而在大腸癌的研究中出現了更為有趣的現象：國內學者[12-14]利用全基因組寡核苷酸技術篩選出NFE2L3為大腸癌高表達基因，并在體外實驗中發現NFE2L3可抑制大腸癌細胞株LoVo和肝癌細胞株SMMC-7721的細胞生長，但對細胞凋亡無明顯影響；國外Chowdhury et al[15]通過實驗證實NFE2L3可通過刺激U2AF同源基序激酶1基因的表達在體外促進大腸癌細胞株DLD-1的細胞增殖，但它們在另一種大腸癌細胞株HCT116中也發現NFE2L3可顯著抑制其細胞增殖。本實驗采用生物信息學的方法預測到NFE2L3基因在RC組織中的表達明顯高于正常對照組(P均<0.05)；進一步應用免疫組化SP法對66例RC及配對的癌旁組織進行檢測顯示：NFE2L3蛋白在RC組織中顯著升高，且與配對癌旁邊組織相比，差異有統計學意義(P<0.001)。這一真實數據結果與生物信息學預測結果相一致，同時也與NFE2L3基因在前述其它惡性腫瘤中的高表達情況相吻合。該結果提示：NFE2L3基因在惡性腫瘤發展、發生等生物學進程中起著關鍵的作用。

繼而對NFE2L3表達水平與RC預后進行研究，經相關性分析顯示：NFE2L3的差異表達與RC患者有無脈管侵犯有關；經Cox多因素生存分析顯示：NFE2L3基金的高表達可作為預測RC患者預后良好的獨立預測因子，該結果與利用GEPIA公共數據庫直腸癌數據預測的生存分析結果相一致，提示NFE2L3高表達與RC患者預后良好相關，該基因可能參與RC轉移、生長等過程并發揮重要調節作用。

而針對NFE2L3在上述不同惡性腫瘤中既有發揮促癌基因的作用亦有抑癌基因的作用，甚至在大腸癌不同細胞株中扮演著相反的角色，這一現象也提示：NFE2L3在腫瘤中所發揮的調控作用存在著較大的異質性，未來仍需要進一步深入探索，剖析其在具體瘤種中的特異性作用及其分子機制。