130株致瀉性大腸埃希菌耐藥譜分析

詹彩梅，梁冬紅，梁敏儀 [廣東醫科大學附屬第三醫院(佛山市順德區龍江醫院)，廣東佛山 528318]

大腸埃希菌(Escheoiehia coli,E. coli) 是腸道重要的正常菌群，為宿主提供一些具有營養作用的合成代謝產物。而致瀉性大腸埃希菌 (Diarrheagenic E.coli, DEC)是引起感染性腹瀉流行和地方腹瀉暴發的主要病原體[1-2]。目前細菌性腸道感染的治療主要依賴于抗菌藥物，由于抗菌藥物的廣泛使用與濫用，致使細菌耐藥性越發嚴重。為了解佛山市某地區細菌性腹瀉病的特征，掌握腹瀉患者DEC的耐藥譜分布，以及為臨床合理用藥提供依據，本研究擬應用紙片擴散試驗(K-B法)對佛山市某醫院腹瀉患者的肛拭子進行耐藥性分析。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

受試的130株大腸埃希菌為2016年1月至2017年10月分離自佛山市某醫院健康體檢樣本。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料 22種藥敏紙片均為Oxoid公司生產，包括氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMC)、氨芐西林(SAM)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢西丁(FOX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻吩(KF)、氯霉素(C)、環丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、鏈霉素(S)、呋喃妥因(F)、美羅培南(MEM)、亞胺培南(IPM)、萘啶酸(NA)、四環素(TE)、甲氧芐氨嘧啶(W)、復方新諾明(SXT)。MH瓊脂：Oxoid MH瓊脂(CLSI標準)Mueller-Hinton Agar CLSI；LB肉湯：北京陸橋技術有限責任公司；SS瓊脂培養基：杭州微生物試劑有限公司；NaCl：廣東光華化學廠有限公司；電子比濁儀：生物梅里埃VITEK Densichek電子比濁器；比濁儀濁度標準：生物梅里埃DENSICHEK CALIBRATION SHANDARD電子比濁器濁度標準93059；恒溫培養箱、恒溫振蕩培養箱等。

1.2.2 藥敏試驗 采用WHO推薦的紙片擴散法(KB法)對菌株做22種常用抗生素的耐藥試驗，結果判斷參照Clinical And Laboratory Standards Institute出版的藥物敏感試驗指南[3]，采用大腸埃希菌國際標準菌株(ATCC 25922)及金黃色葡萄球菌國際標準菌株(ATCC 25923)和銅綠假單胞菌國際標準菌株(ACTT 27853)作質控菌株。⑴將待測菌株從半固體保存管或凍存管中接種至SS平板，(36±1) ℃培養18～24 h，挑取單個新鮮菌落接種于LB瓊脂平板，37 ℃培養18～24 h，挑取單個新鮮菌落置4～5 mL LB肉湯中，(36±1) ℃培養5～6 h。⑵用無菌生理鹽水或肉湯調整新鮮生長的肉湯懸液的濁度到0.5個麥氏濃度。用無菌棉簽蘸取菌液，在管內壁上擠掉多余菌液。用棉簽涂布整個M-H培養基表面。反復3次，每次將平板旋轉約60°，最后沿平板內壁繞兩圈，保證涂均勻。⑶待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片。在菌接種后15 min鐘內貼完紙片，貼好紙片要在15 min將平板反轉，(36±1) ℃孵育16～18 h后取出，在黑色背景下用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近整數毫米數并記錄。抑菌環邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為邊界，根據抑菌圈大小判為敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 致瀉性大腸埃希菌耐藥分布

130株受試 DEC除對美羅培南和亞胺培南不耐藥外，其他抗生素均見耐藥。其中，DEC對萘啶酸的耐藥嚴重，高達60.00%；其次是四環素和氨芐西林，均為35.38%；甲氧芐啶及復方新諾明，耐藥率分別為26.15%和24.62%。DEC對鏈霉素和頭孢噻吩的中介嚴重，分別為70.76%和40.00%。見表1。

表1 大腸埃希菌抗生素敏感性分布 株(%)

2.2 各毒力基因型的耐藥分布情況

130株分離自感染性腹瀉檢測糞便樣品，依照毒力基因分型[4-5]，在受試菌株中，耐藥菌株占84.62%，其中2株EHEC型菌株均為不耐藥菌株，2株EIEC型菌株有1株耐藥，EAEAC、ETEC、EPEC 3種毒力型的菌株中耐藥菌株均超過50.00%。23株EAEC型大腸埃希菌對萘啶酸的耐藥率最高，為56.52%，其次是氨芐西林，為52.17%；EPEC型有35株，耐藥最高的是氨芐西林，為54.29%，其次是四環素和甲氧芐啶，均為48.57%；ETEC型分離最多株，共68株，對萘啶酸的耐藥率最高，達72.46%。這3種毒力基因型對鏈霉素的中介率均超過50.00%，分別為65.20%、57.14%、73.53%。此外，EHEC和EIEC均只分離出2株，EHEC 2株均不耐藥，EIEC有1株耐藥，耐藥譜為氯霉素+慶大霉素+鏈霉素+四環素+甲氧芐啶+復方新諾明，且2種毒力型均對鏈霉素產生中介。

2.3 致瀉性大腸埃希菌多重耐藥情況

有61株出現2種及以上抗生素耐藥，占總株數的46.92%。耐1種抗生素的大腸埃希菌，主要為萘啶酸或四環素耐藥。耐2種及以上抗生素的耐藥譜中，氨芐西林+萘啶酸+甲氧芐啶+復方新諾明最多，有5株。耐1種抗生素的菌株數量最多(47株)，其次為耐2種和4種抗生素(13株)。耐3類及以上抗生素的菌株有45株，其中源自腹瀉患者的11株，源自健康人的34株。108株大腸埃希菌對22種抗生素可分為50種耐藥譜型，以EPEC型大腸埃希菌最為分散，達27種，EAEC型達15種，ETEC型有18種。

由表2可知，EPEC型主要耐藥譜型為四環素和氯霉素+鏈霉素+四環素+甲氧芐啶+復方新諾明；萘啶酸是ETEC型的主要耐藥譜型，其次為四環素；EAEC最主要的耐藥譜型為萘啶酸和氨芐西林+萘啶酸+甲氧芐氨嘧啶+復方新諾明。源自腹瀉患者的菌株耐藥譜型以萘啶酸或四環素為主。

表2 3種毒力基因型大腸埃希菌主要耐藥譜型分布 (株)

3 討論

我國監測資料表明，不同地區 DEC檢出率與優勢種群各不相同，但DEC在腹瀉病原菌中所占比例呈上升趨勢。我國DEC感染類型主要以EPEC和ETEC為主，本研究共檢出5種類型 DEC，其中以EPEC(52.30%)和ETEC(26.92%)為主，這與以往報道相近[6-7]。

本研究通過分析130株分離自感染性腹瀉檢測糞便樣品肛拭子的 DEC，應用22種抗生素對其進行藥物敏感性試驗，結果顯示該地區 DEC對亞胺培南、美羅培南高度敏感(100.0%)，對其他抗菌藥物耐藥性的強度依次為萘啶酸、四環素、氨芐西林、甲氧芐啶、復方新諾明。本文結果顯示， DEC對鏈霉素和頭孢噻吩的中介嚴重，分別為70.76%和40.00%，因此應重視藥敏中介率較高的部分抗菌藥物如鏈霉素、氨芐西林/舒巴坦等的使用。

據資料統計顯示，抗生素開發研制速度遠落后于細菌產生的速度。臨床醫師應用抗生素可以結合參考本地區DEC對抗菌藥物的敏感性，合理選擇和使用抗菌藥物，盡量在相關科室的指導下使用抗生素藥物，避免造成多重耐藥等不良后果。這對延緩細菌耐藥性的產生、控制耐藥菌株的播散和流行，以及研究和開發新型、穩定、高效的抗生素均具有十分重要的意義，此外，無論是腹瀉患者還是健康人，臨床用藥可以首選單環內酰胺類敏感性高的抗生素，可以減少耐藥菌株的發生，有效地降低大腸埃希菌的感染率。