鋅指蛋白84基因促進宮頸癌細胞增殖的初步研究

石海燕，胡維維，張 鑫，呂 晉，楊秀媚，顏 菲 （廣東省佛山市第一人民醫院，廣東佛山 528000）

鋅指蛋白(ZNF)發現于非洲爪蟾卵母細胞的轉錄因子TFⅢA中[1]，是真核生物基因組中分布最廣的蛋白之一，約占人類基因組編碼蛋白數量的1%[2]。ZNF在基因表達調控、細胞分化等方面發揮了重要作用，具有廣闊的臨床診斷和治療前景[3]。目前，只有少數的ZNF基因在宮頸癌中做過相關研究，如ZNF582、ZNF1、ZNF268和ZNF516等[4-7]。而ZNF84基因在宮頸癌中對腫瘤發展的關系未見有相關報道。ZNF84位于人類12號染色體q24-q33區[8]，編碼區有4個外顯子，其中兩個專用于編碼KRAB/FPBA和KRAB/FPB-B模塊，剩余的分別編碼鋅指單元的N末端氨基酸和C末端陣列。目前有關ZNF84的報道較少，Assou等[9]發現ZNF84在胚胎干細胞和卵巢中高表達；Zhang等[10]則認為ZNF84與膿毒病轉錄因子的表達有關。因腫瘤發展中的基因表達部分再現了胚胎發育中的基因特征，我們推測宮頸癌中可能存在ZNF84的異常表達，因此本研究初步探討了ZNF84基因在宮頸病變組織中的表達以及ZNF84對腫瘤細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細胞系Hela細胞和C33a細胞為本單位保存。ZNF84抗體購買自Abcam。內參兔抗人GAPDH多克隆抗體為杭州賢至公司產品。siZNF 84的RNA片段由吉瑪生物技術有限公司合成。PCR引物委托上海生工合成和測序，ZNF84引物F：5’-CCCTTTGGATGTAGTGATTGTAGA-3’， R： 5’-ACTCGACCTCTCT CTAAATGCTT-3’； GAPDH引物 F： 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’， R：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA-3’。PVDF膜、羊抗兔或羊抗鼠二抗購買自碧云天生物技術有限公司。反轉錄試劑盒、PCR試劑購買自大連Takara公司。胎牛血清、細胞培養基(DMEM)和胰蛋白酶-EDTA消化液購自Life technologies公司。雙抗(青霉素、鏈霉素)、Trizol、三氯甲烷、異丙醇、DEPC H2O、蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液、SP二步法免疫組化試劑盒(帶DAB顯色液)、檸檬酸緩沖液(IHC抗原修復液，100×)和蛋白印跡試劑盒均購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 組織來源 宮頸組織均來自本院病理科2015年1月至2016年5月手術切除和活檢的60例標本。其中15例正常宮頸組織，患者年齡為42～56歲，平均年齡(50.0±4.1)歲。45例宮頸癌組織，患者年齡為30～73歲，平均(50.1±5.3)歲；其中高分化癌10例，中分化癌24例，低分化癌11例；FIGO(Feder-ation International of Gynecology and Obstetrics)Ⅰ期21例，Ⅱ～Ⅳ期24例；鱗癌22例，其中高分化2例，中分化17例，低分化3例；FIGOⅠ期12例，Ⅱ～Ⅳ期10例；腺癌23例，其中高分化8例、中分化7例、低分化8例，FIGOⅠ期9例，Ⅱ～Ⅳ期14例。所有納入對象均未接受過放療和化療。

1.2.2 免疫組化 組織標本采用免疫組化SP法檢測。ZNF84一抗稀釋濃度為1∶100，以PBS代替一抗作為空白對照。選取癌細胞較多的5個高倍視野(×400)，每個視野計100個細胞。染色強度分級：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽性細胞百分比分級：陽性細胞<30% 1分，陽性細胞數在30%～60% 2分，陽性細胞數>60% 3分。結果判斷：兩項得分相加 0分為陰性(－)， 1～3分為弱陽性(+)，4～5分為中陽性(++)，6分為強陽性(+++)[11]。

1.2.3 細胞培養 人宮頸癌細胞系Hela細胞和C33a細胞分別用含有10%(體積分數)胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基，置37 ℃、含5%(體積分數)CO2的恒溫細胞培養箱中培養。

1.2.4 細胞轉染 轉染前1d取對數生長期的細胞，經0.25%胰酶消化后顯微鏡下進行細胞計數，按每孔3×105個細胞的密度鋪于6孔板中，按不同的實驗目的進行分組，檢測siZNF84對細胞的影響。每種細胞株設對照組和siZNF84組。細胞完全培養基培養，待細胞匯合度達60%～80%時，按照1 μg質粒：2 μL Lipo2000的比例進行空載體質粒和siZNF84質粒的轉染，4 h后換液繼續培養。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖 將轉染后各實驗組6孔板細胞以每孔5×103細胞密度鋪板于96孔板中，每組細胞設5個復孔，并設3孔培養基作空白組，于l、2、3 d時分別加入CCK8，每孔10 μL，1～2 h后采用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。細胞增殖抑制率計算公式為：(對照組實際吸光度值/干擾組實際吸光度值－l)×100%。

1.2.6 Real-time PCR 采用TRIzol(Invitrogen)法提取總RNA。cDNA的合成是用隨機六聚體引物iScriptcDNA合成試劑盒(BioRad)和500 ng總RNA按說明書制作而成。反應生成的cDNA置于－80 ℃保存。取1 μL cDNA作為模板，加入5 μL SYBR Green Mix、0.2 μL 10 mmol/L上游引物、0.2 μL 10 mmol /L下游引物，5.6 μL ddH2O，混勻后進行定量PCR反應。反應條件為95 ℃預變性10 min， 95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環。每種樣本的siZNF84和GAPDH設3個復孔，反應結束后樣品置于4 ℃保存。定量PCR檢測人宮頸癌細胞系Hela細胞、C33a細胞對照組以及實驗組RNA的表達差異。

1.3 統計學處理

運用SPSS19.0軟件分析實驗結果，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗，計數資料采用(校正)χ2檢驗或確切概率法，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZNF84在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達

ZNF84在宮頸癌組織有表達，而在正常宮頸組織中無表達，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表1。鏡下觀察發現ZNF84蛋白在腫瘤細胞中主要表達于細胞核及核周位置，見圖1。

表1 宮頸癌組織和正常宮頸組織中ZNF84的表達情況例(%)

圖1 ZNF84在正常宮頸(左圖)和宮頸癌組織(右圖)中的表達(×10)

2.2 ZNF84的表達與患者臨床病理特征的關系

ZNF84表達與腫瘤大小、HPV感染有關(P<0.01或0.05)，而與其他臨床病理特征無關(P>0.05)，詳見表2。鱗癌中ZNF84的表達與患者的臨床病理特征均無關系(P>0.05)，詳見表3。腺癌組織中ZNF84的表達與腫瘤大小、HPV感染有關(P<0.05)，而與其他臨床病理特征無關(P>0.05)，詳見表4。

2.3 ZNF84 RNA干擾序列轉染宮頸癌細胞對ZNF84表達的作用

表2 ZNF84的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系

接上表

表3 ZNF84表達與鱗癌患者臨床病理特征的關系

與對照組相比，Hela和C33a組的siZNF84 mRNA分別下降51.1%和57.6%，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.4 干擾ZNF84的表達對宮頸癌細胞的影響

Hela細胞在24、48、72 h分別抑制了32.74%、31.17%和23.54 %，C33a細胞在24、48、72 h分別抑制了22.13%、32.26%和24.32%。siZNF84組細胞數均明顯少于對照組(P<0.05)，見圖3。

圖2 siZNF84轉染Hela細胞和C33a細胞后檢測其RNA及蛋白表達

表4 ZNF84表達與腺癌患者臨床病理特征的關系

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，位居世界第3位，嚴重危害女性的生命健康。研究提示宮頸癌與HPV感染密切相關[11-13]。本研究免疫組化結果表明ZNF84在宮頸癌組織有表達，而在正常宮頸組織中則無表達。45例宮頸癌石蠟切片中有35例ZNF84表達陽性，表達率為77.8%。ZNF84在人類胚胎干細胞和卵母細胞中呈高水平表達[8]，在體內多種器官和組織中均有不同程度的表達，在子宮和宮頸組織中無表達，與本實驗正常宮頸組織中無ZNF84表達的結果一致。ZNF84的表達與宮頸癌患者的腫瘤大小有關(P<0.01)，在3例腫瘤直徑<2 cm的腫瘤組織中未見ZNF84蛋白表達，而在直徑≥2 cm的腫瘤組織中ZNF84的表達率為83.3%，提示宮頸癌組織中出現了ZNF84蛋白亞群。ZNF84表達與宮頸癌組織的HPV感染有關(P<0.05)，HPV感染患者的ZNF84陽性的表達率比非HPV感染患者高。在23例宮頸腺癌組織中ZNF84表達亦與腫瘤大小、HPV感染有關(P<0.05)，而與其他臨床病理特征無關系(P>0.05)，提示ZNF84參與了宮頸癌的發生和發展，或對宮頸癌細胞的增殖能力有一定的影響。

為了探討ZNF84基因對宮頸癌細胞增殖的影響，及其與腺癌和HPV的關系，我們選用了Hela和C33a兩種宮頸癌細胞株進一步研究。Hela細胞為腺癌細胞且HPV18陽性，C33a細胞為HPV陰性。實驗通過干擾該基因mRNA的表達檢測細胞增殖能力的變化。結果表明，siZNF84轉染后，宮頸癌細胞Hela和C33a的ZNF84 mRNA明顯降低，基因表達的差異有統計學意義(P<0.05)，表明本實驗通過RNA干擾技術在宮頸癌細胞中成功干擾了ZNF84的表達。CCK8細胞增殖結果亦表明，兩種細胞株經ZNF84干擾后與對照組比較，其細胞增殖能力均顯著下降(P<0.05)，提示ZNF84在體外可以促進Hela和C33a的細胞增殖。

圖3 siZNF84轉染抑制宮頸癌細胞的增殖能力