長鏈非編碼RNA在鼻咽癌組織中的差異表達(dá)

彭麗嬌，李欣曉，江丹賢，張輝潔，陳 竟，吳偉豪，黃 靜 （廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院. 腫瘤中心；. 耳鼻咽喉科，廣東湛江 5400）

鼻咽癌是起源于鼻咽上皮的惡性腫瘤，年發(fā)病率約高達(dá)10萬人[1-2]。尋找鼻咽癌早期診斷和預(yù)警分子標(biāo)記有助于鼻咽癌的臨床診治[3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類無法編碼蛋白質(zhì)的RNA分子[4-5]，通過與染色質(zhì)、蛋白質(zhì)及其他RNAs的相互作用，廣泛參與表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化調(diào)控等多種生理、病理過程[6]，在細(xì)胞的生長、凋亡、新陳代謝、機(jī)體免疫應(yīng)答及腫瘤發(fā)生中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[7]。大量研究表明，lncRNA 與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在相關(guān)腫瘤中特異性表達(dá)，參與了多種腫瘤的調(diào)控[8-9]。本研究通過高通量lncRNA芯片技術(shù)，對比分析鼻咽癌和正常鼻咽上皮組織的lncRNA表達(dá)譜，從中挑選表達(dá)差異顯著的lncRNA，并通過臨床樣本進(jìn)一步驗證，初步篩選出鼻咽癌發(fā)病特異相關(guān)的lncRNA，為尋找鼻咽癌有效的診治靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2016年10月至2017年4月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行內(nèi)鏡下活檢的鼻咽癌組織(30例)，所有標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)確診，同時以正常鼻咽上皮組織為對照(25例)。組織標(biāo)本在離體后立即置入凍存管中投入液氮保存。隨機(jī)選取3對鼻咽癌組織和正常鼻咽上皮組織(患者臨床資料詳見表1)作為lncRNA芯片檢測樣本。實驗獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗材料

組織總RNA提取試劑RNAiso Plus(Takara，中國)，RNA純化試劑盒(QIAGEN，德國)，cRNA合成和標(biāo)記試劑盒(Agilent technologies，美國)，SYBR Green I(Takara，中國)，紫外分光光度計ND-2000(NanoDrop， 美 國 )， ABI 7500熒 光 定 量 PCR儀(Applied Biosystems，美國)。lncRNA芯片為上海伯豪公司的4×180 k human ceRNA 表達(dá)芯片，包含了68 423條lncRNA和18 853條mRNA。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織RNA抽提 將凍存管從液氮中取出，用眼科剪將組織樣本剪成約1 mm3的小塊置入離心管中并加入1 mL RNAiso Plus，用研磨儀充分研磨直至無肉眼可見組織塊。加入200 μL氯仿，渦旋混勻后離心，吸取出上清液至另一離心管，加入等體積異丙醇，靜置后離心。棄上清，加入1 mL 70%乙醇洗滌，離心棄上清，干燥沉淀后加入適量的RNase-free水溶解沉淀，－80 ℃保存。

1.3.2 芯片雜交、掃描及數(shù)據(jù)讀取分析 按照Agilent公司的表達(dá)譜芯片試劑盒(Low Input Quick Amp Labeling Kit，One-Color)說明書對樣品RNA進(jìn)行放大和標(biāo)記，用RNeasy Mini Kit純化標(biāo)記后的cRNA。按照Agilent公司表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套的試劑盒組裝好雜交倉，將標(biāo)記后的樣本置于雜交爐中，65 ℃，10 r/min，雜交17 h后用洗脫試劑盒洗片。采用Agilent Microarray Scanner掃描雜交后的芯片。用Feature Extration軟件讀取芯片原始數(shù)據(jù)，歸一化處理后分別繪制散點圖、火山圖和熱圖，并進(jìn)行GO分析和KEGG pathway分析。

1.3.3 qRT-PCR 用上海凈信研磨儀將組織樣本研磨均勻，以Takara公司的RNAiso Plus提取總RNA，并用NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀測定產(chǎn)物的濃度和純度。按PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以人β-actin為內(nèi)參基因，用SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ(Tli RNaseH Plus)在美國ABI7500系統(tǒng)中完成PCR擴(kuò)增，以2-△CT計算基因的相對表達(dá)量。引物信息見表2。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，用獨立樣本t檢驗分析結(jié)果，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織RNA抽提結(jié)果

NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀檢測樣本總RNA，所有樣品RNA的OD 260/280為1.8～2.1，28 s/18 s RNA條帶灰度比值均≥1.5，滿足芯片實驗要求，詳見表3。

2.2 lncRNA差異表達(dá)分析

表1 患者臨床資料

表2 lncRNA引物序列

如圖1所示，lncRNA在鼻咽癌組織標(biāo)本和正常鼻咽組織標(biāo)本中呈離散分布。鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)(紅色)和下調(diào)(藍(lán)色)的lncRNA，詳見圖2，其中紅色區(qū)域代表差異倍數(shù)≥2且P<0.05的差異表達(dá)lncRNA，藍(lán)色區(qū)域代表差異倍數(shù)≤0.5且P<0.05的差異表達(dá)lncRNA。聚類分析直觀顯示每個樣本中不同lncRNA的表達(dá)水平，如圖3所示，兩組樣本中l(wèi)ncRNA的表達(dá)存在顯著差異(P<0.05)。

2.3 芯片檢測結(jié)果

比較鼻咽癌組織及正常組織中的lncRNA表達(dá)水平，將差異表達(dá)倍數(shù)≥2且P<0.05的lncRNA定義為差異表達(dá)lncRNA。結(jié)果篩選出差異表達(dá)lncRNA共454個，其中在鼻咽癌組織中上調(diào)表達(dá)的lncRNA有173個，下調(diào)表達(dá)的有281個。差異表達(dá)上調(diào)10倍以上的lncRNA共13個(表4)，差異表達(dá)下調(diào)5倍以上的lncRNA共11個(表5)。同時檢測出767個差異表達(dá)mRNA，其中上調(diào)表達(dá)305個，下調(diào)表達(dá)462個。

圖1 鼻咽癌差異表達(dá)的lncRNA散點圖

圖2 鼻咽癌差異表達(dá)的lncRNA火山圖

圖3 鼻咽癌差異表達(dá)的lncRNA聚類分析圖

表4 鼻咽癌組織中差異表達(dá)上調(diào)10倍以上的lncRNAs

2.4差異表達(dá)lncRNA的靶基因預(yù)測

對差異表達(dá)lncRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，11個差異表達(dá)上調(diào)10倍以上的lncRNA中，9個lncRNA有cis調(diào)控的靶基因，1個lncRNA有trans調(diào)控的靶基因，1個lncRNA既有cis調(diào)控又有trans調(diào)控的靶基因，詳見表6。

2.5 qRT-PCR驗證

為進(jìn)一步驗證基因芯片結(jié)果，選取芯片中上調(diào)的lnc-RBBP8-1:2和lnc-MICALL2-1:8兩個lncRNA，采用qRT-PCR在55例組織標(biāo)本中檢測它們的表達(dá)量。結(jié)果顯示，與正常鼻咽上皮組織相比，lnc-RBBP8-1:2和lnc-MICALL2-1:8在鼻咽癌組織中均明顯表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)，與芯片檢測結(jié)果一致。

表5 鼻咽癌組織中差異表達(dá)下調(diào)5倍以上的lncRNAs

表6 差異表達(dá)lncRNAs的靶基因預(yù)測

圖4 lnc-RBBP8-1:2(A)和lnc-MICALL2-1:8(B)在鼻咽癌和正常鼻咽組織中的表達(dá)水平

3 討論

眾所周知，真核生物基因組能夠轉(zhuǎn)錄多種不同大小、豐度和蛋白質(zhì)編碼能力的RNA分子。目前只有少量的非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物能在實驗室條件下測定其功能，與RNA的多樣性形成了鮮明的對比，且除蛋白質(zhì)編碼基因外，很少發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的基因突變[10]。因大多數(shù)lncRNA在生物體內(nèi)的表達(dá)水平低，這在RNA深度測序方法出現(xiàn)之前，對其研究仍是一大難題[11]。近年來，隨著RNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的lncRNA走進(jìn)了人們視野。根據(jù)lncRNA從基因組中被轉(zhuǎn)錄的位置不同，可將其分為5大類：獨立型(stand-alone lncRNAs)，也叫基因間型(lincRNAs)，如HOTAIR；反義型(antisense)，如Xist/Tsix；假基因型(pseudogenes)；長內(nèi)含子型(long intronic ncRNAs)，如COLDAIR；啟動子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄RNA型(Divergent transcripts,promoter-associated transcripts, and enhancer RNAs)，如(pas)RNAs、(e)RNA[12]。lncRNA可以在多個層面上調(diào)控表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)，參與X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N生物學(xué)過程，并且在腫瘤發(fā)生過程中有重要的調(diào)控作用[13-15]。

迄今為止，研究人員已經(jīng)鑒定了多種腫瘤中異常表達(dá)的lncRNA，初步解釋了其臨床意義。Yu等[16]通過重新利用微陣列探針對GEO數(shù)據(jù)集分析了人胰腺癌和非腫瘤組織中的lncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)數(shù)百個lncRNA在胰腺癌組織中差異表達(dá)，用基因敲除的方法證明LINC00152和CASC9在胰腺癌細(xì)胞中的促進(jìn)增殖和侵襲的作用。Gu等[17]使用微陣列分析，在6對胃癌和相鄰正常組織樣品中鑒定了1 297個lncRNA存在差異表達(dá)，并進(jìn)一步證實UCA1、lincRNABBOX1-2在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，而CR594506和BC015134則表達(dá)下調(diào)，編碼-非編碼共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)揭示了這4個lncRNA與26個mRNA存在相關(guān)性。賈搏等[18]利用lncRNA表達(dá)譜芯片檢測了3對舌鱗癌組織及正常舌組織中 lncRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)3 590 個lncRNA表達(dá)失調(diào)。越來越多的研究提示lncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能成為癌癥患者診斷和治療的潛在分子標(biāo)記物。

在鼻咽癌研究中， Li等[19]通過深度測序?qū)⒈茄拾┓暖煹挚辜?xì)胞株CNE-2-Rs與親代細(xì)胞CNE-2進(jìn)行比較，在細(xì)胞層面上發(fā)現(xiàn)2 835個lncRNA差異表達(dá)，并通過qRT-PCR驗證和靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)lncRNA與鼻咽癌放療抵抗的潛在關(guān)系。目前報道的與鼻咽癌發(fā)病 相 關(guān) 的 lncRNAs包 括 HOTAIR、 HNF1A-AS、lncRNA-LET、 H19、 NEAT1、 AFAP1-AS1、FOXD2-AS1、MALAT1、CCAT1、XIST等[20-30]，說明lncRNA在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用。我們對于lncRNA的功能、類型、生物學(xué)意義依然了解甚少。本研究借助lncRNA芯片分析了鼻咽癌和鼻咽正常組織表達(dá)譜的變化情況，按照表達(dá)差異倍數(shù)2倍以上且P<0.05條件進(jìn)行篩選，共獲得454個差異表達(dá)的lncRNA，其中在鼻咽癌組織中上調(diào)173個，下調(diào)281個，與鼻咽正常組織相比，鼻咽癌組織中存在明顯的lncRNA差異表達(dá)，提示lncRNA可能參與了鼻咽癌的發(fā)病過程。為了解lncRNA在鼻咽癌中的作用，我們利用生物信息學(xué)技術(shù)對差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行了靶基因預(yù)測，結(jié)果顯示lncRNA可能通過cis和trans兩種方式對靶基因進(jìn)行調(diào)控。為進(jìn)一步驗證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們從中挑選了在鼻咽癌組織中上調(diào)表達(dá)的2個lncRNA：lnc-RBBP8-1:2和lnc-MICALL2-1:8。這些lncRNA在既往的研究中均未見報道。通過qRT-PCR檢測方法在55例組織標(biāo)本中進(jìn)一步驗證了它們的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常鼻咽上皮組織相比，lnc-RBBP8-1:2和lnc-MICALL2-1:8在鼻咽癌組織中的表達(dá)量均顯著升高，與芯片檢測結(jié)果一致，提示lnc-RBBP8-1:2和lnc-MICALL2-1:8極有可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。

本實驗初步探索lncRNA在鼻咽癌中的表達(dá)變化情況，為進(jìn)一步研究lncRNA在鼻咽癌中的具體功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)將繼續(xù)圍繞lnc-RBBP8-1:2和lnc-MICALL2-1:8對鼻咽癌生物學(xué)行為的影響展開實驗，深入探討lncRNA在鼻咽癌發(fā)病過程中的作用，為鼻咽癌的診治提供新的靶點。