骨髓間充質干細胞條件培養液對H2O2損傷HepG2細胞保護作用的研究

王東明，邢曉偉，葉曉梅，陳 稚，李寶紅，茍占平，吳都督 （廣東醫科大學藥學院，廣東東莞 523808）

隨著社會人口的老齡化，阿爾茲海默癥(Alzheimer disease，AD)、帕金森癥(Parkinson disease， PD)等神經退行性疾病的發病率逐年增加，給社會和家庭都帶來了沉重的負擔。然而，目前該類疾病的病因存在很多的可能性和不確定性[1]。近年的研究表明，線粒體功能障礙、內質網應激、氧自由基損傷等能造成氧化性損傷參與了其致病過程，氧化應激在神經退行性疾病的發生發展過程中起著重要的作用[2-5]。因此，抗氧化治療為該類疾病的治療提供了依據。近年的大量研究表明，間充質干細胞具有潛在的多向分化能力，它能在機體的損傷部位分泌許多不同的神經營養因子，這些因子能促進該損傷部位血管增生、組織再生等，因此其可修復中樞神經系統疾病的損傷及促進組織功能的改善[6-9]。進一步研究發現，骨髓間充質干細胞發揮治療作用在一定程度上也與其分泌的細胞因子有關[10-11]。由于HepG2細胞常被用于構建氧化應激損傷的細胞模型[12-17]，因此本研究以HepG2細胞為模型，探究了BMCs-CM對其增殖的影響，并用H2O2誘導成氧化損傷模型，檢測了其細胞內外各指標的變化情況，并探討了其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性SD大鼠，體質量(90.6±10.1) g，由廣東醫科大學動物實驗中心提供；肝癌細胞株HepG2由廣東醫科大學中藥與新藥研究所提供；CCK8試劑盒(日本同仁)；0.25 %胰蛋白酶(含EDTA，吉諾生物公司)；L-DMEM、H-DMEM培養基(美國GIBCO公司)；胎牛血清(FBS，美國GIBCO公司)；H2O2溶液(分析純，Sigma)；二甲基亞砜(DMSO，Solarbio公司)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，Solarbio公司)；細胞裂解液(RIPA，碧云天)；PMSF蛋白酶抑制劑(碧云天)；BCA法蛋白定量試劑盒(碧云天)；丙二醛(MDA)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性測定試劑盒(均來自南京建成生物工程研究所)；一抗(兔抗鼠IgG，SantaCruz公司)；二抗(熒光標記的山羊抗兔IgG，Santa Cruz公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF，美國Milipore公司)；6×SDS-PAGE蛋白上樣定量試劑盒(Thermo scientific公司)；脫脂奶粉(MBCHEM公司)。

恒溫水浴鍋(金壇市杰爾瑞電器有限公司)；細胞恒溫培養箱(美國Thermo公司)；－80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)；漩渦混勻器(北京六一儀器廠)；imark 酶標儀(美國Bio-Rad公司)；常溫及低速離心機(德國Eppendorf公司)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；AUW120D電子天平(日本Shimadzu公司)；DYCP-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)；轉膜儀、轉膜槽(美國Bio-Rad公司)；WB紅外顯影儀(美國Gene Company Linited 公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMCs細胞的分離、培養 采用頸椎脫臼的方法處死SD大鼠，再用體積分數為75 %的乙醇浸泡約15 min。在無菌條件下對其脛骨和股骨進行處理，用 10 mL滅菌注射器吸取L-DMEM 培養液反復吹打骨髓腔，直至骨髓細胞充分流出，將其制成單細胞懸液，加入含有10%FBS的L-DMEM培養基，置于37 ℃、5%CO2細胞恒溫培養箱中培養。原代培養2 d后首次換液以去除不貼壁細胞，之后每2天換液1次，待貼壁細胞融合度達80%～90%再用含EDTA胰酶消化，按1∶3比例進行傳代培養。

1.2.2 MSCs 培養上清液的收集 選擇第5～7代細胞，待細胞融合度達70%～80%后用PBS清洗，隨之用H-DMEM培養基培養，在37 ℃、5%CO2條件下孵育12 h 后收集上清，3 000 r/min離心3 min，棄細胞碎片后標記所得培養液為MSCs-CM，－80 ℃保存。

1.2.3 HepG2細胞培養 將HepG2細胞按5×105個/mL接種于含10%FBS的H-DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養。每2天更換1次培養基，3 d后傳代，常規胰蛋白酶消化傳代，選取對數生長期的細胞做實驗。

1.2.4 BMCs-CM對HepG2細胞增殖的影響 采用CCK8法檢測BMCs-CM對HepG2細胞生存率的影響。將處于對數生長期的HepG2細胞按5 000個/孔加入96孔板，每孔體積為100 μL，培養24 h后棄上清。對照組加入含5%FBS的H-DMEM培養基100 μL，另外3個實驗組在含5%FBS的H-DMEM培養基中加入不同體積分數的MSCs-CM(低、中、高體積分數分別為10%、20%、40%)。每組設1個空白孔和5個復孔，繼續培養24、48、72 h后向各孔加入CCK8試劑10 μL，37 ℃、5%CO2烘箱孵育1 h后，采用酶標儀在450 nm處測OD值。取5個孔的均數，細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中，As：實驗孔，Ac：對照孔，Ab：空白孔。

1.2.5 CCK8檢測BMCs-CM對HepG2細胞的保護將處于對數生長期的HepG2細胞按6 000個/孔加入96孔板，每孔體積為100 μL，37 ℃、5% CO2烘箱培養24 h。實驗分為5組：對照組、H2O2損傷模型組(200 μmol/L H2O2)、MSCs-CM低含量處理組(10% MSCs-CM+200 μmol/L H2O2)、MSCs-CM中 含 量 處 理 組(20% MSCs-CM+200 μmol/L H2O2)、MSCs-CM高含量處理組(40% MSCs-CM+200 μmol/L H2O2)，每組1個空白孔和5個復孔，繼續培養24 h后向各孔加入CCK8試劑10 μL，37 ℃、5%CO2烘箱孵育1 h后，采用酶標儀在450 nm處測OD值。取5個孔的均數，細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中，As：實驗孔，Ac：對照孔，Ab：空白孔。

1.2.6 檢測HepG2細胞上清液中LDH、MDA含量和SOD活力 收集1.2.5中分組處理后各組細胞上清液，分別參照3個測試盒說明書進行操作，隨后用酶標儀在對應波長即在450、530、450 nm處測定OD值并根據相應公式計算LDH、MDA含量及SOD活力。

1.2.7 檢測HepG2細胞內MDA含量及SOD活力 將HepG2細胞培養于6孔板，按照1.2.5進行分組：對照組、H2O2損傷模型組、BMCs-CM低、中和高含量處理組。處理后用細胞刮將細胞刮下，隨后將細胞轉移離心，超聲破碎后制成懸液，漩渦混勻器混勻，4 000 r/min離心10 min后取上清液，參照MDA、SOD測試盒說明書進行操作，450 nm波長下測定OD值并根據相應公式計算MDA含量及SOD活力。

1.2.8 BMCs-CM對HepG2細胞Nrf-2蛋白表達的影響 用對照組、H2O2損傷模型組、BMCs-CM+H2O2組和BMGs-CM組分別處理HepG2細胞24 h后，去掉培養基并用冷PBS洗2次，置于冰上。按RIPA∶PMSF= 100∶1比例每孔加150 μL RIPA細胞裂解液及1.5 μL PMSF蛋白酶抑制劑，在冰上裂解20 min。用細胞刮刮細胞碎片和裂解液，每孔刮5 min，隨后轉移至1.5 mL EP管中，在1×104r/min、4 ℃離心30 min。取2.5 μL上清液用于BCA法測定蛋白體積分數，其余轉移至1.5 mL EP管中并在－80 ℃保存。取各組50 μg蛋白樣品于10% SDS-聚丙烯凝膠電泳進行分離(5%濃縮膠65 V，30 min；分離膠90 V，2 h)。將分離后的蛋白電轉移(4 ℃，300 mA電流，120 min)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。PBST洗膜，加入熒光二抗室溫孵育120 min，隨之紅外熒光顯影儀顯影，用Image J圖像分析蛋白條帶的灰度值。Nrf-2蛋白的表達量以β-actin作為內參。

1.3 統計學處理

應用SPSS18.0軟件進行統計學處理，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析和Newman-Keuls檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMCs-CM對HepG2細胞增殖的影響

CCK8檢測結果顯示：與對照組相比，HepG2細胞存活率隨BMCs-CM作用時間的延長而明顯增大，隨BMCs-CM含量的增高而增大，差異有統計學意義(P<0.01)。其中在同一含量比較下，BMCs-CM各含量組72 h的細胞存活率均比48 h的低，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表1。

2.2 CCK8檢測BMCs-CM對HepG2細胞的保護作用

表1 BMCs-CM對HepG2細胞存活率的影響 ±s，%)

表1 BMCs-CM對HepG2細胞存活率的影響 ±s，%)

同一時段，與對照組比較：a P<0.01；同一含量組，與24 h比較：b P<0.01，cP<0.01

images/BZ_15_205_1671_2272_1738.png對照組BMCs-CM低含量組BMCs-CM中含量組BMCs-CM高含量組6 6 6 6 100.00±0.02100.00±0.03100.00±0.02 105.60±2.80a 131.16±1.20ab 119.46±3.74ac 129.10±2.71a 150.62±3.14ab 134.78±3.25 ac 150.18±3.07 ac 145.07±2.40a 175.32±2.35ab

CCK8結果顯示：H2O2損傷模型組中可知200 μmol/L H2O2對HepG2細胞殺傷性較大，其細胞存活率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。BMCs-CM低、中、高含量組的細胞存活率明顯比H2O2損傷模型組高，且呈現出含量依賴性，差異有統計學意義(P< 0.01)，詳見表2。

表2 BMCs-CM對H2O2誘導損傷后的HepG2細胞存活率的影響 ±s，%)

表2 BMCs-CM對H2O2誘導損傷后的HepG2細胞存活率的影響 ±s，%)

與對照組比較：aP<0.01；與H2O2損傷模型組比較：bP<0.01

images/BZ_15_225_2658_1154_2729.png對照組 100.00±0.02 H2O2損傷模型組52.26±3.02 BMCs-CM低含量組a 67.70±2.41 BMCs-CM中含量組ab 76.84±1.92 BMCs-CM高含量組6 6 6 6 6 ab 83.64±2.09ab

2.3 HepG2細胞上清液中LDH活性、MDA含量及SOD活力的測定

各檢測試劑盒結果顯示：與對照組比較，H2O2損傷模型組細胞上清液中LDH活性、MDA含量增加，SOD的活力降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與H2O2損傷模型組比較，BMCs-CM低、中、高含量組可降低損傷后的HepG2細胞培養液中LDH活性和MDA含量的增高，差異有統計學意義(P<0.01)；同時能有效地改善HepG2細胞培養液中SOD的活力水平(P<0.01)；此外，LDH活性、MDA含量隨BMCs-CM含量的升高而顯著降低，SOD活力則顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表3。

2.4 HepG2細胞內MDA含量及SOD活力的測定

各檢測試劑盒結果顯示：與對照組相比，H2O2損傷模型組的HepG2細胞內MDA含量增大，而SOD活力降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與H2O2損傷模型組相比，BMCs-CM各含量組均可使HepG2細胞內MDA含量降低，使SOD活性增高。而隨著BMCs-CM含量的增大，MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表4。

表3 BMCs-CM對H2O2誘導HepG2氧化損傷后細胞上清液中LDH、MDA及SOD的影響 ±s)

表3 BMCs-CM對H2O2誘導HepG2氧化損傷后細胞上清液中LDH、MDA及SOD的影響 ±s)

與對照組比較：a P<0.01；與H2O2損傷模型組比較： bP<0.01

images/BZ_16_208_443_2275_509.png對照組H2O2損傷模型組BMCs-CM低含量組BMCs-CM中含量組BMCs-CM高含量組6 6 6 6 6 208.64±40.760.19±0.0446.53±0.18 1257.36±71.65a 0.78±0.03a 25.08±0.33a 1046.70±52.61ab 0.67±0.01ab 28.73±0.64ab 772.51±42.75ab 0.42±0.04ab 41.85±0.34ab 659.29±46.53ab 0.35±0.03ab 45.52±0.22ab

表4 BMCs-CM對H2O2誘導HepG2細胞內MDA含量及SOD活力的影響 ±s)

表4 BMCs-CM對H2O2誘導HepG2細胞內MDA含量及SOD活力的影響 ±s)

與對照組比較：aP<0.01；與H2O2損傷模型組比較：bP<0.01

images/BZ_16_220_1161_1149_1232.png對照組H2O2損傷模型組BMCs-CM低含量組BMCs-CM中含量組BMCs-CM高含量組6 6 6 6 6 28.25±3.85213.32±11.64 157.71±4.76a 99.23±5.51a 139.36±6.54ab 118.32±4.15ab 79.25±4.43ab 149.43±6.73ab 63.76±3.74ab 178.52±8.71ab

2.5 BMCs-CM對HepG2細胞Nrf-2核蛋白表達水平的影響

Western blot結果顯示：與對照組相比，BMCs-CM組Nrf-2核蛋白表達明顯增加(P<0.01)，H2O2損傷模型組中Nrf-2核蛋白表達明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)；與H2O2損傷模型組相比，BMCs-CM+H2O2組對HepG2細胞核中Nrf-2蛋白的表達具有明顯的上調作用，差異有統計學意義(P<0.01)；BMCs-CM組Nrf-2核蛋白也明顯比BMCs-CM+H2O2組的表達高，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見圖1、表5。

圖1 BMCs-CM對HepG2細胞的Nrf-2核轉運的影響

3 討論

表5 BMCs-CM對HepG2細胞的Nrf-2核轉運的灰度值的影響 ±s)

表5 BMCs-CM對HepG2細胞的Nrf-2核轉運的灰度值的影響 ±s)

與對照組比較：aP<0.01；與H2O2損傷模型組比較：b P<0.01；與BMCs-CM+H2O2組比較：cP<0.01

images/BZ_16_1321_1071_2250_1137.png對照組H2O2損傷模型組BMCs-CM+H2O2組BMCs-CM組6 6 6 6 1.058±0.045 0.463±0.032a 1.275±0.054ab 2.234±0.106abc

氧化應激反應與神經退行性疾病有著錯綜復雜的關系。神經元對氧化應激反應有高度的敏感性，越來越多的研究證據表明氧化應激與神經退行性疾病的病因與發病機制關系密切，氧化應激可以導致神經細胞損傷或死亡[18]。顯然，通過抗氧化治療以保護神經細胞顯得尤為重要[19]。H2O2是一種重要的活性氧，雖然本身不具備自由基的性質，但其極易透過細胞膜進入細胞，與細胞內鐵離子發生Fenton反應形成高活性的自由基，導致脂質過氧化等一系列反應，因其易于獲得且性質相對穩定的特點，所以它是研究各類細胞氧化損傷的常用物質之一。HepG2細胞來源于人類肝癌細胞，并且保留了人類正常肝細胞的許多特殊功能[20]，如保留了抗氧化酶的活性。有文獻報道，BMCs發揮修復損傷作用的主要機制可能是它的旁分泌作用[21]，這說明BMCs-CM是一種很有研究價值的條件培養液。但BMCs-CM對HepG2細胞氧化損傷的保護作用鮮有報道，所以在HepG2細胞中，BMCs-CM是否能夠對H2O2誘導的氧化損傷具有保護作用還需實驗驗證。 本實驗通過H2O2為氧化劑誘導HepG2細胞建立的氧化損傷模型進行研究，CCK8檢測結果表明， BMCs-CM單一作用對HepG2細胞無毒性；當不同含量BMCs-CM+H2O2作用于HepG2細胞時，BMCs-CM能夠提高該細胞氧化損傷后的存活率，提示BMCs-CM對H2O2誘導HepG2細胞氧化損傷具有保護作用。

H2O2氧化損傷HpG2細胞時，細胞膜通透性增強，而LDH是一種存在于機體所有組織細胞胞質內的糖降解酶，在氧化損傷狀態下，LDH會從胞內釋放到胞外，該酶活力明顯上升，因此胞外LDH的活性能反映細胞的損傷程度。SOD是一種能使超氧化物陰離子自身發生氧化還原反應的內源性金屬酶，能清除超氧陰離子自由基保護細胞免受損傷，因此SOD活力的高低間接反應了機體清除氧自由基的能力。MDA 是脂質過氧化反應后的氧化終產物之一，MDA使得細胞膜結構和功能受到損傷，影響一系列生理生化反應的正常進行，具有細胞毒性，因此MDA的含量常常可反映機體內脂質過氧化的程度，也間接反映了細胞損傷的程度[22]。即當機體發生氧化損傷時，細胞膜通透性改變，胞內LDH 向外釋放；引發自由基鏈反應消耗大量SOD；引發脂質過氧化反應產生許多MDA，致使細胞損傷、死亡[23]。因此，在H2O2誘導HepG2細胞發生氧化損傷的狀態下，細胞存活率、LDH釋放量、MDA生成量、SOD活力發生會明顯的變化。本實驗結果表明，BMCs-CM可降低該氧化損傷細胞上清液中LDH 的釋放量、降低MDA的水平，增強SOD的活力。由此可見，BMCs-CM對H2O2誘導HepG2細胞氧化損傷的保護作用與提高細胞抗氧化酶活性、降低自由基水平有關，同時猜測其可能與其分泌的細胞因子有關。

研究發現，核轉錄因子Nrf-2是氧化應激和外源性有毒物質的感受器，以Keap1-Nrf 2-ARE信號通路介導抗氧化基因和II相解毒酶的轉錄，降低ROS引起的細胞損傷程度，抵抗機體體內氧化-抗氧化的失衡，而且Nrf-2在神經退行性疾病中也發揮著重要的作用[24-26]。正常生理狀態下，胞漿中Nrf-2與Keapl結合形成復合體失去活性，而在氧化應激狀態下，Keapl構型發生改變可導致Nrf-2與Keapl解離，Nrf-2釋放出來后轉位進入核內，從而啟動下游基因的轉錄及其蛋白的表達以減輕氧化應激引起的損傷。本文通過Western blot實驗探討HepG2氧化損傷細胞模型中Nrf-2蛋白的表達，結果顯示，BMCs-CM組明顯增加Nrf-2蛋白的表達水平。說明經BMCs-CM組處理可能導致HepG2細胞胞質中的Nrf-2從復合體中解離釋放出來，并轉位進入細胞核內，從而發揮抗氧化作用。也揭示了BMCs-CM可能是基于對Keap1-Nrf 2-ARE信號通路的調節來發揮對H2O2誘導HepG2細胞氧化損傷的保護作用機制。

綜上所述，BMCs-CM對HepG2氧化損傷細胞具有保護作用，其機制可能與BMCs-CM降低LDH、MDA含量，增強SOD活力并調控Keap1-Nrf 2-ARE信號通路中的關鍵蛋白Nrf-2的表達水平有關。這證實了BMCs-CM作為抗氧化劑實現對HepG2細胞氧化損傷保護作用的可行性，也為神經系統退行性疾病在抗氧化治療方面提供了實驗基礎。