稽留流產患者蛻膜組織輔助性T17細胞、調節性T細胞及其相關細胞因子的表達觀察

王婭萍，李敏清，覃琴紅，韋江璇

(1廣西醫科大學，南寧530022；2廣西醫科大學第一附屬醫院)

稽留流產是指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔未能及時自然排出者，若不能得到及時診治，會導致母體凝血功能異常、DIC等[1]。稽留流產病因復雜，可能與染色體異常、內分泌異常、感染和免疫因素等[2～5]有關。母體通過一系列免疫調節應答對胚胎產生耐受，母胎的免疫平衡可維持胎兒的正常發育，這個過程與輔助性T(Th)細胞和調節性T(Treg)細胞密切相關[6, 7]。Th17細胞是一類獨立的CD4+T細胞亞群，可特異性高分泌白細胞介素(IL-17)，介導炎癥反應，誘發自身免疫病。Treg細胞是具有免疫調節功能的T細胞，與Th17在功能上互相拮抗，可分泌TGF-β使免疫下調。研究[8]表明，Th17/Treg免疫失衡參與復發性流產等不良妊娠的發生。而在稽留流產患者血清中Treg細胞比例降低[9]。目前關于稽留流產患者蛻膜組織Th17細胞、Treg及其相關細胞因子IL-17、IL-21、IL-10、TGF-β表達相關報道較少。我們觀察了稽留流產患者蛻膜組織Th17細胞、Treg細胞及其相關細胞因子IL-17、IL-21、IL-10、TGF-β的表達變化，探討Th17/Treg免疫失衡在稽留流產發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年9月～2018年6月在廣西醫科大學第一附屬醫院計劃生育門診的30例稽留流產患者作為觀察組，同期30例正常早孕要求行人工流產手術患者作為對照組，以經陰道彩超和人絨毛膜促性腺激素水平動態監測結果為診斷依據。兩組孕婦均為單胎自然受孕，既往無不良孕產史，排除子宮及宮頸病變，夫婦雙方染色體正常，排除生殖道感染，排除內分泌代謝紊亂性疾病及自身免疫疾病，男方精液常規檢查正常。通過末次月經推算孕周，超聲測量胚胎的頭臀長以確認，兩者相差大于2周者不納入本研究。觀察組年齡22～35(27.43±3.74)歲，孕周6～10(7.57±1.04)周；對照組年齡23～34(27.93±3.32)歲，孕周在6～9(7.70±0.95)周，兩組年齡、孕周間差異無統計學意義。兩組均行腹部B超引導行負壓吸宮術，將宮腔內容物置于0.9%生理鹽水中漂洗干凈，分離出蛻膜組織，保存備檢。本研究已獲得我院倫理委員會的批準，患者及其家屬均已知情同意。

1.2 試劑與儀器 PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD4、PE Mouse Anti-Human IL-17A、PE Mouse Anti-Human CD25、647 Mouse Anti-Human FoxP3、Human FoxP3 Buffer Set A+B均購自于美國BD公司，兔抗人IL-17抗體、兔抗人IL-21抗體、兔抗人IL-10抗體、兔抗人TGF-β抗體、S-P超敏試劑盒、DAB顯色液、過氧化氫溶液由福建邁新生物技術開發有限公司提供，低溫高速離心機、流式細胞儀由美國Beckman公司生產。

1.3 蛻膜組織Th17、Treg細胞比例測算 取兩組蛻膜組織Percoll細胞分離液分離出淋巴細胞。CD4+IL17+Th17 檢測：取淋巴細胞懸液加入800 μL血清培養基和200 μL 的PMA，37 ℃避光孵育4 h，PBS洗滌重懸后加入4 μL的Hu CD4 PerCP-Cy5.5于4 ℃冰箱避光30 min，250 μL破膜劑破膜后4 ℃避光30 min，加入20 μL的 Hu IL-17A PE MAB，4 ℃避光30 min，PBS洗滌重懸后用流式細胞儀檢測Th17細胞占CD4+T淋巴細胞的比例。CD4+CD25+Treg 檢測：取淋巴細胞懸液加入4 μL 的Hu CD4 PerCP-Cy5.5、20 μL 的PE Mouse Anti-Human CD25混勻，避光孵育30 min，加500 μL的 Hu FOXP3 Buffer，避光20 min，PBS洗滌，加20 μL FOXP3-647避光30 min，PBS洗滌重懸后用流式細胞儀檢測Treg細胞占CD4+T淋巴細胞的比例。重復3次，取平均值。

1.4 蛻膜組織IL-17、IL-21、IL-10、TGF-β檢測 采用免疫組化法。取兩組蛻膜組織取出石蠟切片脫蠟并水化，使用PH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液煮沸，熱修復抗原90 s，3%H2O2室溫孵育15 min，非免疫血清封閉40 min，加一抗(兔抗人IL-17抗體、IL-21抗體、IL-10抗體、TGF-β抗體工作濃度分別為1∶400、1∶300、1∶5 000、1∶400)4 ℃孵育過夜。加入生物素標記的二抗，室溫孵育20 min，室溫孵育20分鐘，DAB顯色5 min，自來水充分洗滌；蘇木素復染1 min，水洗反藍；梯度酒精脫水，二甲苯液透明，中性樹膠封片。免疫組化的染色強度用平均光密度(OD)來表示。在×400光學顯微鏡下，每張切片隨機選取5個視野拍照，使用ImagePro Plus6.0軟件分析計算圖片的OD值，每張切片的OD值為5個視野OD值的平均值，代表相應蛋白的表達量。重復3次，取平均值。

2 結果

觀察組、對照組蛻膜組織Th17細胞百分比分別為7.21%±1.30%、5.91%±1.06%，Treg細胞百分比分別為5.75%±1.05%、7.385±1.25%，觀察組、對照組蛻膜組織Th17/Treg分別為1.31±0.41、0.82±0.18,兩組比較，P均<0.05。觀察組、對照組蛻膜組織IL-17相對表達量分別為0.058±0.007、0.047±0.009，IL- 21相對表達量分別為0.030±0.009、0.024±0.006，IL-10相對表達量分別為0.028±0.01)、0.035±0.009，TGF-β相對表達量分別為0.026±0.007、0.038±0.008，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

免疫學研究表明，自然妊娠是一種半同種異體移植的過程，母體的蛻膜和胚胎的滋養細胞共同組成母胎界面，免疫細胞間的微環境可維持母胎免疫耐受，對妊娠的正常進行起重要作用[4]。以往對免疫平衡的研究[10]集中在Th1/Th2，Th1主要參與細胞免疫應答，Th2參與體液免疫應答，Th1/Th2是維持正常妊娠的必要條件。近年來有學者[11]認為，Th1/Th2平衡學說無法全面解釋母胎免疫耐受機制，遂在此基礎上，提出了Th17/Treg 平衡學說。

Th17 細胞是一類獨特的Th亞群，可分泌IL-17、IL-21等細胞因子，參與炎癥反應和免疫應答，在妊娠早期，其表達下調[12]。IL-17是Th17的主要效應因子，能有效地介導中性粒細胞的動員興奮過程，從而有效介導組織的炎癥反應，其與受體結合后通過MAP 激酶途徑及核轉錄因子途徑發揮生物學作用。IL-17作為一種致炎細胞因子，主要由活化的T細胞產生，同時又可以促進T 細胞的激活以及產生更多的促炎因子。IL-17在多種自身免疫疾病的組織和血清中異常性高表達[13]，在復發性流產患者蛻膜組織IL-17含量較正常早孕患者高[14]。IL-21是Th17產生的另外一種可維持機體免疫功能的重要細胞因子，其可能通過抵抗Treg細胞誘導的母胎免疫保護作用以及通過對Th17的正反饋調節使母胎免疫耐受形成受阻[15]。CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞為調節性T細胞，包括Tr1、Th3等。Treg細胞的特征性標志為高表達轉錄因子Foxp3，而后者也是決定其功能的關鍵基因[16]，可促進 Tr1分泌高水平的IL-10和中等水平的TGF-β，從而抑制幼稚型和記憶型T細胞增殖反應，防止自身免疫病的發生，以及促進Th3分泌大量TGF-β，抑制免疫效應細胞的增殖和分化[17]。孕期母體內Treg 細胞表達增加，并在母體免疫細胞到達胎盤滋養層初次接觸胎兒抗原時起重要免疫保護作用，當Foxp3表達下降時，可直接影響Treg細胞的數量和功能，進而降低母體對胎兒的免疫耐受，增加免疫排斥，導致病理妊娠[18]。

以往Th17/Treg平衡在不良妊娠的研究多集中在不明原因復發性流產(RSA)及先兆流產，RSA患者外周血及蛻膜組織中Th17占CD4+T細胞的比例高于正常早孕患者，同時Treg 細胞比例降低[19,20]，而稽留流產作為不良妊娠的一種特殊類型，其外周血Treg 細胞比例較正常早孕患者低[10]。在本研究中，觀察組患者蛻膜組織中Th17細胞比例、Th17/Treg比值、Th17相關細胞因子IL-17、IL-21的表達量均高于正常早孕人流患者，同時Treg細胞比例、IL-10和TGF-β的表達量均低于對照組。這說明在稽留流產的發病過程中，具有促炎作用的Th17 細胞發揮免疫應答作用，上調IL-17、IL-21表達，IL-17可誘導炎癥因子聚集于母胎界面[21]，而IL-21又對Th17 細胞的表達有促進作用，同時具有免疫抑制功能的Treg 細胞表達降低，Th17/Treg比例失衡導致母胎界面的免疫排斥反應，對胚胎的著床和發育產生不良影響，促進不良妊娠，進而導致稽留流產的發生。

綜上所述，在稽留流產患者的蛻膜組織中，Th17細胞及相關細胞因子表達增加，而Treg細胞及相關細胞因子表達降低，Th17/Treg比例失衡在稽留流產的發生發展中起重要作用。但本研究樣本例數較少，可能存在一定的偏倚，尚需大樣本的實驗進一步證實，而Th17/Treg對稽留流產的影響機制也需更深入的研究。