黃芪甲苷對柯薩奇B組3型病毒感染乳鼠心肌細胞及病毒性心肌炎乳鼠心肌細胞的修復作用觀察

楊秀華，肖云峰，劉天龍，劉小玲，張勇，楊宏昕，劉小雷

(1內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特010110；2呼倫貝爾職業技術學院；3內蒙古醫科大學附屬醫院;4內蒙古自治區人民醫院)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是最常見的感染性心肌炎。引起VMC的病毒主要是腸道病毒和上呼吸道感染病毒，其中以柯薩奇B組3型病毒(CVB3)最為常見[1]。近年來，VMC的發病率呈上升趨勢，尤其是兒童、青壯年發病率較高，發病初期常見發熱、全身酸痛、胸痛、疲倦等一般病毒感染癥狀，因此常因誤診不被患者所重視而延誤病情[2]，嚴重VMC感染可導致心力衰竭、心源性休克甚至猝死。乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸磷酸激酶(CK-MB)是診斷VMC的標志性心肌酶。目前VMC的臨床治療主要以對癥治療、提高機體的免疫力及抗病毒治療為主[3]，目前尚無統一安全有效的抗VMC藥物。黃芪甲苷(AsⅣ)是從蒙古黃芪根莖中提取分離的主要活性成分，具有補氣升陽、益衛固表、托毒生肌、利水消腫等功效。黃芪具有增強免疫、強心降壓、降血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等功效，可用于冠心病、心絞痛等疾病的治療[3]。目前關于AsⅣ治療VMC的效果相關報道較少。2017年9月～2018年6月，我們分別觀察了AsⅣ對CVB3感染的乳鼠心肌細胞及VMC乳鼠心肌細胞的保護作用，并分析其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物及儀器 SPF級新生1～3 d SD乳鼠，由內蒙古大學實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK(蒙)2002-0001；SPF級昆明種雄性小鼠75只，體質量18～22 g，由內蒙古大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(蒙)2002-0001。人宮頸癌Hela細胞株由軍事醫學科學院楊秉呼博士惠贈，Vero細胞株由中國預防醫學科學院病毒研究所惠贈；CVB3(Nancy)毒株由中國醫學科學院病毒所惠贈；AsⅣ(110781，中國藥品生物制品檢定所)；LDH測定試劑盒(142715003，南京建成生物工程研究所)；CK-MB試劑盒(14271500，南京建成生物工程研究所)。

1.2 AsⅣ對CVB3感染的乳鼠心肌細胞的保護作用觀察

1.2.1 CVB3病毒擴增及病毒滴度(TCID50)檢測 ①CVB3病毒擴增[4]取Hela細胞株培養于25 cm2培養瓶中，當長成單層細胞時加入1 mL CVB3病毒液，吸附1 h后棄上清，加5 mL全DMEM培養基，在孵箱中培養。于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，當細胞變為單個細胞并發生部分破裂時，終止培養。反復凍融3次，最終完全釋放病毒顆粒時移入離心管，1 500 rpm離心15 min，收集上清液，-20 ℃保存備用。②TCID50[5]檢測 取Vero細胞用全DMEM培養基將病毒液稀釋，濃度范圍為10-1～10-8稀釋度。將已長成單層細胞的培養液棄去，接種不同濃度的病毒液，記錄細胞病變(CPE)的孔數，以CPE達“++”以上為陽性，以最高稀釋度不再出現CPE為終點；用 Reed-Muench 法計算 TCID50，得CVB3病毒的TCID50為6.76，即能夠使50%細胞發生CPE的病毒濃度為10～76 /mL，最終選擇1 000 TCID50作為正式實驗的接種濃度。

1.2.2 原代乳鼠心肌細胞分離與培養[6]取新生1～3d SD乳鼠，75%乙醇消毒，迅速剪取心臟心尖處，將心臟均勻剪成約1 mm3的組織塊，棄上清。加入6 mL 0.1% 胰酶輕輕吹打，37 ℃消化6 min。加入5 mL 0.08%胰酶及0.05% Ⅱ型膠原酶的混合液，37 ℃消化5 min，吸取上清液轉移至另一預冷玻璃瓶中，5 mL的10% DMEM/F12培養基終止消化，重復上述步驟，共消化10次。200目篩網去除大量組織，1000 rpm離心8 min，20% DMEM/F12培養基重懸細胞，37 ℃、5% CO2孵箱中培養，差速貼壁60 min，將細胞懸液轉移至另一培養瓶中，繼續培養，細胞達到融合狀態時開始后續實驗。倒置顯微鏡下可見培養48 h時細胞基本全部貼壁，細胞呈圓形、梭形及多角形，大多數都已伸出偽足，邊界清晰可見，并且有自發性節律性搏動；培養72 h細胞伸出偽足并相互觸及交織成網，逐漸形成細胞簇，并且同步搏動，搏動頻率60～90次/min；培養5～7日細胞搏動頻率逐漸達到高峰(110次/min)。α-actin免疫組化染色后乳鼠心肌細胞染色為陽性，胞質內存有棕黃色絲狀物質，細胞純度達95%以上。

1.2.3 AsⅣ對乳鼠心肌細胞的最大無毒濃度(TC0)測算 取乳鼠心肌細胞分為正常對照、AsⅣ(濃度分別為320、160、80、40、20 mg/L),每組每個濃度3個復孔。分別將不同濃度藥物加入到已長成單層細胞的96孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，高濃度AsⅣ對細胞的毒性較大，表現為細胞形態發生改變，出現脫落、死亡；隨著AsⅣ濃度的降低，對心肌細胞的毒性反應也逐漸減弱。當AsⅣ達到無毒濃度時，給藥的細胞和正常對照細胞的CPE沒有明顯的區別。顯微鏡下記數CPE的孔數，當不再變化時，用 Reed-Muench 法測算AsⅣ的TD50為40 mg/L，TC0為20 mg/L。

1.2.4 加入AsⅣ的CVB3感染心肌細胞存活情況觀察及細胞上清液中LDH、CK-MB檢測 取乳鼠心肌細胞分為正常對照組、病毒對照組、AsⅣ組。將密度為5×105/mL的心肌細胞接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱內培養24 h，病毒對照組和AsⅣ組分別用1 000 TCID50的病毒感染心肌細胞，共培養1 h棄去含有病毒的培養液。AsⅣ組分為五個亞組，分別加入20、10、5、2.5、1.25 mg/L的AsⅣ，顯微鏡下每日觀察CPE。當病毒對照組中75%以上的細胞出現病變時結束培養。每孔加入MTT液(0.5 mg/mL)20 μL，培養4 h，吸棄原培養液，每孔加入DMSO 100 μL,振搖5 min，于酶標儀490 nm處讀取光密度值(OD值)，根據每組細胞的OD值計算細胞存活率，實驗重復3次，取平均值；收集各組細胞上清液，采用全自動生化分析儀對處理樣本進行檢測，檢測指標為LDH、CK-MB，實驗重復3次，取平均值。

1.3 AsⅣ對VMC小鼠心臟的保護作用觀察

1.3.1 小鼠分組及AsⅣ給藥方法 采用隨機數字表法將75只小鼠分為正常對照組、模型對照組、AsⅣ高劑量組、AsⅣ中劑量組、AsⅣ低劑量組，每組15只。除正常對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射1 000 TCID50 CVB3病毒液0.1 mL/只，建立VMC動物模型。小鼠接種病毒24 h時，AsⅣ高、中、低劑量組分別給予4、2、1 g/kg的AsⅣ灌胃，正常對照組、模型對照組每日予0.5%羧甲基纖維素鈉20 mL/kg灌胃，各組均灌胃7 d。灌胃第8 d脫頸椎處死各組小鼠。

1.3.2 各組小鼠心肌組織病理形態觀察 處死各組小鼠后留取心肌組織，沿左心室長軸切開，用10%甲醛固定后石蠟包埋切片，HE染色，觀察各組心肌細胞、心肌組織病理學改變。

1.3.3 各組小鼠血清中LDH、CK-MB測定 將麻醉小鼠眼眶取血，靜置30 min，用3 000 /min,10 min離心取血清。采用全自動生化分析儀對處理好的樣本進行檢測，檢測指標為LDH、CK-MB，實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 加入AsⅣ的CVB3感染的心肌細胞OD值比較 空白對照組、病毒對照組細胞OD值分別為0.702 8±0.021 1、0.461 8±0.045 0，20、10、5、2.5、1.25 mg/L的AsⅣ組細胞OD值分別為0.621 0±0.097 8、0.618 9±0.089 0、0.612 3±0.098 7、0.603 4±0.879 3、0.576 4±0.108 9。與空白對照組比較，病毒對照組及AsⅣ組各亞組細胞OD值降低(P均<0.05)；與病毒對照組比較，及AsⅣ組各亞組細胞OD值升高(P均<0.05)。

2.2 加入AsⅣ的CVB3感染的心肌細胞細胞上清液LDH、CK-MB含量比較 空白對照組CVB3感染的心肌細胞LDH、CK-MB含量分別為(49.21±1.98)、(83.6±12.72)U/L，病毒對照組CVB3感染的心肌細胞LDH、CK-MB含量分別為(82.17±2.31)、(122.36±15.48)U/L，1.25、2.5、5、10、20 mg/L的AsⅣ組心肌細胞LDH含量分別為(78.24±1.56)、(73.56±2.32)、(72.21±3.21)、(67.83±2.14)、(64.56±3.12)U/L，CK-MB含量分別為(120.66±3.27)、(108.37±2.12)、(97.48±3.67)、(95.65±2.16)、(86.75±3.15)U/L。與正常對照組比較，病毒對照組心肌細胞LDH、CK-MB含量升高(P均<0.05)；與病毒對照組比較，10、20 mg/L的AsⅣ組心肌細胞LDH、CK-MB含量降低(P均<0.05)。

2.3 加入AsⅣ的VMC小鼠心肌組織病理形態 模型對照組及AsⅣ低、中劑量組分別死亡4、1、2只。與空白對照組比較，病毒對照組心肌組織排列紊亂，淋巴細胞和單核細胞出現介導的炎性浸潤、心肌細胞出現明顯出血水腫甚至壞死。AsⅣ組不同劑量心肌組織排列紊亂情況輕，淋巴細胞和單核細胞出現介導的炎性浸潤、心肌細胞輕微出血水腫，心肌組織壞死以點狀炎癥和壞死灶為主。

2.4 加入AsⅣ的VMC小鼠血清LDH、CK-MB含量測定結果比較 見表1。與空白對照組比較，模型對照組心肌細胞LDH、CK-MB含量升高(P均<0.05)；與模型對照組比較，AsⅣ高、中、低劑量組心肌細胞LDH、CK-MB含量降低(P均<0.05)。

表1 各組乳鼠心肌細胞LDH、CK-MB含量

3 討論

中藥黃芪是來源于豆科黃芪屬植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，史載于《神農本草經》中，具有顯著的補氣升陽、益衛固表、托毒生肌、利水消腫等功效，根據現代藥理學研究表明，黃芪具有增強免疫、強心降壓、降血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤的功效，臨床上可用于冠心病、心絞痛、病毒性心肌炎等疾病的治療中。目前，黃芪己被列入我國衛生行政部門制定的有關病毒性心肌炎常規治療方案中。本研究中所用的AsⅣ是從蒙古黃芪中分離純化的主要活性成分，在藥典中被作為黃芪質量檢測標志物[17]。現代研究表明，AsⅣ具有抗炎[8]、抗氧化[9,10]、抗病毒[11]、增強免疫力[12]等藥理作用。

原代乳鼠心肌細胞的體外培養，是將出生1～3天乳鼠心臟組織剪碎，用特定濃度的消化酶進行消化，使心肌組織變成單個的心肌細胞，在適宜的體外環境下，貼壁生長的一種細胞培養技術。原代乳鼠心肌細胞在感染CVB3病毒后3～5天就可以發生較明顯的細胞病變，早期便可以直接損害心肌細胞。臨床上一般采用檢測心肌酶的表達水平來間接檢測心肌細胞的損傷程度，LDH、CK-MB是診斷病毒性心肌炎的標志性心肌酶。在CVB3感染的心肌細胞模型中，由于心肌細胞受損，細胞膜通透性升高，胞內酶大量釋放進入血液中，導致LDH、CK-MB的活性升高[18]。AsⅣ治療組(20、10、5 mg/L)CPE明顯減輕，細胞搏動有力。MTT染色結果顯示，給藥各濃度組與病毒對照組比較，給藥組的細胞存活率明顯增高，細胞搏動較好，形態正常，兩組間平均OD值有顯著性差異。故AsⅣ作用于CVB3感染的心肌細胞后，細胞病變明顯減輕，上清液中的心肌酶的活性明顯降低，差異有統計學意義，說明AsⅣ可以減輕CVB3感染所造成的心肌細胞損傷，能維持心肌細胞正常功能，對心肌細胞具有較好的保護作用。在CVB3感染的小鼠模型中，通過HE染色法可觀察到感染病毒的小鼠的心肌組織形態，病毒對照組心肌組織排列紊亂，淋巴細胞和單核細胞出現介導的炎性浸潤、心肌細胞出現明顯出血水腫甚至壞死。AsⅣ給藥組尚可觀察到病灶出現，以點狀炎癥和壞死灶為主，病變程度相對于病毒對照組較輕，能明顯減輕CVB3感染的心肌組織病變程度。

綜上所述，加入AsⅣ可促進CVB3感染心肌細胞的存活，加入AsⅣ的VMC乳鼠心肌細胞炎癥反應輕，AsⅣ對CVB3感染的心肌細胞和VMC乳鼠心肌細胞均具有明顯的保護作用，AsⅣ可明顯抑制CVB3感染，減輕了CVB3感染造成的心肌損傷，其機制可能為AsⅣ通過減少LDH和CK-MB的釋放、抑制病毒增殖以及對心肌細胞及心肌組織的保護作用，但其具體治療機制尚有待于進一步研究。