非小細胞肺癌組織中GLI3蛋白的表達變化及其意義

陳盈盈，李曉琴，劉春玲

(新疆醫科大學第三臨床醫學院(附屬腫瘤醫院)，烏魯木齊 830011)

根據國際癌癥研究署2018年發布的全球癌癥統計資料顯示，當今世界肺癌仍然是發病率和病死率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命安全[1]。Hh信號通路發現以來，不僅在調控人類胚胎發育和干細胞的分化中至關重要，而且和惡性腫瘤密切相關，其在非小細胞肺癌(NSCLC)演化中起重要作用[2～4]。GLI3蛋白作為通路下游轉錄因子GLI蛋白家族中的一員，具備雙向調節功能[5]，在Hh信號通路中的作用十分關鍵，但目前罕有關于GLI3蛋白NSCLC的研究。本研究通過觀察NSCLC組織中GlI3蛋白的表達變化，分析GLI3蛋白表達與NSCLC臨床病理參數、預后的關系，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年1～12月新疆醫科大學第三臨床醫學院(附屬腫瘤醫院)收治的NSCLC患者82例，男56例，女26例；年齡39～75歲，中位年齡62.5歲；有吸煙史26例；有淋巴結轉移35例；瘤體>3 cm 38例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期46例，ⅢA期36例；病理類型：腺癌43例，鱗癌39例。手術留取NSCLC組織82例份及癌旁組織(距腫瘤組織5 cm以外)各82例份。所有組織樣本取下后立即液氮冷凍，隨后轉入-80 ℃冰箱保存。

1.2 NSCLC及癌旁組織中GLI3蛋白檢測方法 采用免疫組化法。選取NSCLC及配對的癌旁石蠟組織標本各82例份。以4 μm厚度為基準連續切片，60 ℃下烤片3 h，浸泡二甲苯、過梯度酒精脫蠟(依次順序為100%-100%-95%-95%-90%-80%-70%)、入去離子水水化；修復組織抗原后，使用免疫組化油筆圈住組織，經3%過氧化氫去離子水孵育10 min，再分3次置入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中；后吸除多余PBS液，即刻滴入第一抗體，入37 ℃恒溫箱孵育1 h，待孵育完成后，使用吸水紙吸去多余一抗，再次使用PBS液沖洗3次同上；擦干多余PBS液，滴加二抗，室溫下孵育30 min，重復上法PBS中浸洗3次，每缸仍為5 min；擦干切片，置入新鮮配置的DAB顯色液中顯色，清水沖洗后入蘇木素染色液中復染1 min，浸溫水返藍；依次過梯度酒精脫水(順序為70%-80%-90%-95%-95%-100%-100%)，依次浸泡缸2缸二甲苯透明，封片。光鏡下觀察結果。以同一條件下染色的陽性顆粒作陽性對照組，用PBS代替一抗作陰性對照組。免疫組化結果判定標準：GLI3蛋白主要定位在細胞核和細胞質，當出現淡黃色至深褐色為陽性細胞，在目標表達部位染色后，采用染色強度與陽性細胞計數相結合的二級計分法進行評分，染色強度無計0分、淡黃色計1分、黃褐色計2分、深褐色計3分，陽性細胞數為10%計0分、10%～25%計1分、26%～50%計2分、51%～100%計3分，兩者相乘，<6分為低表達，>6分為高表達[6]。

1.3 患者預后隨訪 采用查閱患者門診復查和住院復查資料，以及電話、短信、微信、電子郵箱等方式進行隨訪。依據NSCLC指南和診療規范，術后第1年內，無臨床癥狀或癥穩定的患者，每3個月行1次門診或住院檢查隨訪，此后每6個月隨訪復查1次。隨訪至隨訪時間結束或患者死亡，失訪者隨訪時間按截尾數據處理。

1.4 統計學方法 采用SPSS24.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC及癌旁組織中GLI3蛋白表達比較 NSCLC及癌旁組織中GLI3蛋白高表達者分別為49例(59.8%)、31例(37.8%)，兩者比較，P<0.05。

2.2 GLI3蛋白高表達與NSCLC臨床病理參數之間的關系 結果見表1。

表1 GLI3蛋白高表達與NSCLC臨床病理參數的關系

注：GLI3蛋白高表達與NSCLC腫瘤直徑及腫瘤淋巴結轉移有關(P均<0.05)。

2.3 NSCLC組織中GLI3蛋白表達與患者預后的關系 根據GLI3蛋白表達水平將NSCLC患者分為高表達者(49例)及低表達者(33例)，中位生存時間分別為50個月、57個月，兩者比較，P<0.05。

3 討論

近年隨著醫療水平的進步，肺癌的總體生存期有了一定程度的提高，但是預后仍然不夠理想，個體化差異太大，5年生存率為4%～18%[1]，整體預后仍待改善。隨著分子生物學的不斷發展及其在腫瘤學領域的不斷應用，腫瘤的研究早已進入了基因分子水平。Hh信號通路因其在機體調控的廣泛作用和疾病中異常改變，吸引了無數研究者的關注。在脊椎動物中，HH信號通路的主要組成結構有作為配體的三個同源Hh分泌蛋白(SHH、DHH、IHH)及分布于靶細胞膜上的受體Smo蛋白和轉錄因子GLI蛋白家族等[7]。果蠅在Hh信號通路中只有一個GLI轉錄因子的同源基因(Ci)，而在生命架構更高級的脊椎動物中，GLI蛋白家族有3個成員(GLI1、GLI2和GLI3)[8]。近年研究揭示，GLI蛋白不僅參與Hh信號傳導，而且與肺惡性腫瘤的發生發展密切相關，如在小細胞肺癌中，常常伴有GLI蛋白的異常激活[9]；GLI1和GLI2則可介導NSCLC癌細胞的增殖、凋亡及耐藥等機制的發生[1,11]；但作為Hh-GLI信號通路中的主要傳導介質，GLI3蛋白在NSCLC的研究尚淺。2010年白曉燕等[12]曾闡述，GLI3在NSCLC組織中的表達水平高于正常組織，但迄今為止，關于GLI3蛋白在NSCLC中的表達差異及與NSCLC臨床病理參數、患者預后關系的研究仍不充分。

Steg等[13]發現，在胰腺癌中，應用siRNA干擾GLI3蛋白的表達，可減弱癌細胞的活力；Trnski[14]則發現，應用氯化鉀抑制糖原合成酶激酶-3β，可以促進GLI3蛋白加工成抑制形態和減少直腸癌細胞增殖，并可誘導腫瘤細胞凋亡；此外在急性髓性白血病中，有學者通過降低GLI3蛋白抑制區活性，發現可以阻止腫瘤細胞增殖[15]。鐘文等[16]應用siGLI3干擾GLI3蛋白表達，發現GLI3蛋白的表達能促進癌細胞遷移；Fu等[17]進行的功能實驗表明，GLI3蛋白甲基化在體外和體內有助于NSCLC中的腫瘤生長和轉移。因此，我們可以推測，GLI3蛋白在部分腫瘤中呈高表達，且可通過調控GLI3蛋白的活性，促進腫瘤的發生發展；并且在NSCLC中，GLI3蛋白可能存在有2種不同的調控機制和作用方式。本研究顯示，NSCLC癌組織中GLI3蛋白表達水平高于癌旁組織。

腫瘤體積大小是腫瘤TNM分期的重要決定因素，轉移則一直以來被認為是腫瘤導致患者死亡的主要因素，而其中淋巴結轉移是NSCLC患者最常見也是最主要的轉移方式，是顯著影響其臨床預后的重要因素[18]。Popper等[19]發現，腫瘤通過淋巴路徑的轉移相比較血行擴散，通常需要更長的時間才會出現遠處轉移。Ye等[20]最近的一項研究表明，淋巴結轉移與NSCLC患者的長期癌癥特異性存活率(CSS)相關。此外還有許多研究已證實，腫瘤直徑和淋巴結轉移之間密切相關，如Rami-Porta等[21]進行的大量數據的研究發現，腫瘤體積越大越大，NSCLC患者的5年生存率越小，淋巴結轉移率越高，并隨著腫瘤向肺周圍組織轉移的程度而增加，生存惡化的趨勢越顯著。故尋找能可靠預測患者腫瘤轉移的因素，是研究者期望解決的難題。Armas等[22]研究發現，在惡性腫瘤的早期階段，GLI3蛋白在HH-GLI通路中優先表達。本研究顯示，NSCLC組織GLI3蛋白高表達主要與患者的腫瘤直徑及淋巴結轉移有關，可以預測GLI3蛋白可能是腫瘤增殖發育旺盛和轉移傾向明顯的一個潛在標志物。

盡管胚胎期GLl3主要在Hh信號通路起負調控作用[23]，但本研究顯示，GLI3蛋白的高表達是NSCLC患者預后生存的獨立影響因素，GLI3蛋白可通過抑制NSCLC細胞增殖分化，增強腫瘤細胞的轉移能力，促進肺癌的進展和轉移。結合Marie-Ange等[24]研究發現，GLI3蛋白通過增加細血管密度，促進腫瘤病情進展。本研究顯示，GLI3蛋白表達水平高表達者中位生存時間較低表達者短。因此我們推測，GLI3蛋白對NSCLC病情的發展具有重要的促進作用，但是其具體作用方式還需進一步的研究，同時GLl3對NSCLC的影響也可能具有多種的作用形式。

總之，NSCLC組織中GLI3蛋白呈廣泛高表達狀態，且與腫瘤直徑及淋巴結轉移關系密切，GLI3蛋白可能在NSCLC的發生發展中起一定的作用。