乙酰輔酶A合成酶2低表達人胃癌細胞株MGC80-3的順鉑敏感性觀察

糜磊，武丹，陶清，周月鵬，陳德玉

(江蘇大學附屬醫院，江蘇鎮江212001)

胃癌化療抵抗形成的原因之一在于腫瘤細胞較強的凋亡抵抗能力，導致化療效果減弱以及失敗后的再增殖、轉移和復發等進程[1]。已有研究[2～4]證實，在多種腫瘤細胞中乙酰輔酶A合成酶2(ACSS2)可通過將乙酸鹽、輔酶A以及三磷酸腺苷(ATP)等生成乙酰輔酶A，參與腫瘤的生長、侵襲、轉移等。但在不同研究[5，6]中ACSS2表達強度對腫瘤預后以及治療拮抗的影響尚存在較大爭議。核因子κB(NF-κB)即p65，它的激活形式是磷酸化后形成p-p65，當前眾多研究指出，作為抗凋亡轉錄因子，它的激活會誘導許多抗凋亡因子產生，比如B淋巴細胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、B細胞淋巴瘤-特大型蛋白(Bcl-xL)[7, 8]，同時也會下調凋亡蛋白Bcl-2相關的X蛋白(Bax)的表達[9]。我們觀察了ACSS2低表達的人胃癌細胞株MGC80-3順鉑(DPP)敏感性，旨在揭示ACSS2在胃癌DDP抵抗效應形成的具體作用。

1 材料與方法

1.1 ACSS2、細胞及試劑 ACSS2購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，人胃癌細胞株MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87以及正常胃黏膜上皮細胞系RGM-1購自于上海吉凱基因化學技術有限公司， 均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。轉染細胞所用NC及siRNA-ACSS2購于上海吉瑪制藥技術有限公司，轉染siRNA均為標準步驟，siRNA-ACSS2正義鏈5′-UAUGCUUGGUGACAGGCUCAUCUCC-3′；反義鏈5′-GGAGAUGAGCCUGUCACCAAGCAUA-3′；NC：正義鏈5′-GCGACGAUCUGCCUAAGAUdTdT-3′；反義鏈5′-AUCUUAGGCAGAUCGUCGCdTdT-3′。RPMI1640培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司，DPP購自上海Selleck公司，CCK-8試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Bcl-2、Bcl-xL、Bax、p65、p-p65以及β-Actin單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1細胞ACSS2蛋白檢測 采用Western blotting法。取對數生長期MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1細胞，離心測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸10 min變性處理。經聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，將蛋白電轉移至PVDF膜上，封閉60～90 min后置于稀釋好的ACSS2(1∶1 000配置)抗體稀釋液中4 ℃冰箱孵育過夜；再次洗滌后加入抗鼠或抗兔HRP標記二抗室溫孵育60 min，清洗加入曝光液顯影、拍攝并利用藍翔化學分析軟件分別測定目的蛋白及β-Actin的灰度值，目的蛋白與對應β-Actin灰度值之比即為目的蛋白的相對表達量，重復3次，取平均值。

1.3 MGC80-3細胞分組、siRNA轉染及DDP給藥方法 對數生長期MGC80-3細胞分為A、B、C、D組，B及D組分別進行轉染小干擾RNA(siRNA)實驗，加入10 μL脂質體Lipofectamine 2000+5 μL siRNA-ACSS2轉染， C組加入及A組分別加入50 μL無血清純RPMI1640培養基+5 μL 陰性對照(NC)；A、B組均培養72 h，C組培養48 h時加入5 μg/mL的DDP繼續處理24 h，D組轉染48 h時加入5 μg/mL的DDP繼續處理24 h。

1.4 各組MGC80-3細胞增殖活力檢測 采用CCK8法。取各組細胞，每組6個復孔，每孔加入10 μL的CCK8，震蕩、孵育1～2 h后在酶聯檢測儀450 nm 波長下檢測各組OD值，按細胞增殖活力(%)=(OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%公式計算細胞相對活力。OD處理組為B、C組孔的OD值；OD空白組為只含培養基和CCK8溶液而無細胞的孔的OD值；OD對照組為A、D組孔的OD值。

1.5 各組凋亡MGC80-3細胞檢測 采用流式細胞分析術。取各組細胞，用不含EDTA胰酶消化離心后用預冷的PBS洗2次，每管用500 μL標記緩沖液重懸，避光下先加入5 μL的Annexin V-FITC，待臨上機前15 min加入10 μL PI，用流式細胞儀觀察各組細胞凋亡情況。

1.6 各組細胞ACSS2、p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，所有操作均同“1.2”，重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1細胞ACSS2蛋白相對表達量比較 MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1細胞ACSS2蛋白相對表達量分別為0.80±0.03、0.62±0.04、0.60±0.04、0.72±0.05、0.41±0.04。與RGM-1細胞比較，MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87細胞ACSS2相對表達量升高(P均<0.01)；MGC80-3細胞ACSS2相對表達量比其余胃癌細胞高，因此后續實驗選擇MGC80-3細胞進行。

2.2 各組細胞增殖活力比較 A、B、C、D組細胞增殖活力分別為98.67%±4.89%、92.67%±7.86%、62.67%±4.05%、34.67%±7.61%，A組與B組相比無明顯差異(P>0.05)；與A組比較，C組細胞增殖活力下降(P<0.001)；與B、C組比較，D組細胞增殖活力均下降(P均<0.001)。

2.3 各組細胞凋亡情況比較 A、B、C、D組早期細胞凋亡率分別為1.06%±0.02%、1.13%±0.08%、7.62%±0.55%、14.33%±0.21%，晚期細胞凋亡率分別為8.01%±0.05%、8.13%±0.06%、10.81%±0.43%、15.98±0.18%。與A組比較，C、D組細胞早、晚期凋亡率均升高(P均<0.05)；與B組比較，D組早、晚期凋亡率均升高(P均<0.05)；與C組比較，D組細胞早、晚期凋亡率均升高(P均<0.05)。

2.4 各組細胞ACSS2、p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白相對表達量比較 見表1。與A組比較，C組p-p65、Bax蛋白相對表達量升高，Bcl-2、Bcl-xL相對表達量降低(P均<0.05)；與B組比較，D組細胞p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL相對表達量均降低、Bax相對表達量升高(P均<0.05)。

表1 各組MGC80-3細胞ACSS2、p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白相對表達量比較

3 討論

胃癌目前以手術、放療及化療的綜合治療為主要干預手段，但受限于早期轉移、治療拮抗等因素，5年生存率僅在15%～30%[1, 2, 10, 11]。化療在胃癌綜合治療方案中有著至關重要的作用，其中DPP作為常見一線治療用藥而被廣泛應用，然而抵抗效應的產生造成治療失敗也制約了化療藥物在臨床的使用。

ACSS2是一種將乙酸鹽轉化為乙酰輔酶A的代謝酶，直接參與到細胞能量代謝以及物質轉化，同時因其可以影響組蛋白乙酰化進程進而可以發揮表觀遺傳學修飾，調控細胞特別是腫瘤細胞的多種生物學行為：腎癌組織中ACSS2表達強度要遠高于癌旁正常組織，同時腎癌細胞通過促進LAMP1蛋白表達促進侵襲、轉移發生[5]；在腫瘤細胞中ACSS2調控乙酸鹽攝取和利用進而參與脂質合成以及組蛋白乙酰化等進程[12]；在腫瘤特定微環境下如低氧、脂質缺乏等條件下，腫瘤細胞通過激活ACSS2表達來維持其增殖活力[13]；在膀胱癌中ACSS2可能通過參與脂質代謝最終影響順鉑耐藥形成，可以作為潛在預后判斷的標記[3, 4]。因此探討ACSS2在胃癌化療敏感性中的作用、相關機制并尋找可以逆轉耐藥形成的潛在靶點，顯然對有效提高治療效果和患者生存率具有重要的臨床價值。

本研究結果發現，胃癌細胞株中ACSS2的表達強度更高，可見其在胃癌細胞中擔負著十分重要的作用。通過CCK8及流式細胞學分析發現干擾ACSS2表達之后對細胞增殖及凋亡情況無明顯影響，但結合順鉑處理后發現，干擾ACSS2表達會導致胃癌細胞增殖活力明顯下降，并且凋亡率顯著升高。結合上述不同類型腫瘤中ACSS2的作用，我們猜測胃癌細胞中ACSS2表達可能參與化療敏感性調節。胃癌細胞中靶向下調ACSS2表達可以抑制p-p65的形成，NF-κB作為核轉錄因子，在信號轉導過程中其活化形式p-p65的形成、轉位參與到胃癌細胞增殖、轉移、治療拮抗等多個生物學效應[1, 14]。已有研究[10,11]發現，當胃癌細胞高表達抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等，抑制促凋亡相關蛋白如Bax生成時，可對順鉑、紫杉醇等化療藥物產生抵抗效應，而這一進程涉及到復雜的分子相互作用。在本實驗中通過干擾ACSS2表達而抑制p-p65形成的同時Bcl-2蛋白表達量也出現了下調， 結合順鉑處理后，進一步證實siRNA-ACSS2處理促進了促凋亡蛋白Bax的生成。

綜上所述， 人胃癌細胞株ACSS2高表達。ACSS2低表達的MGC80-3細胞DDP敏感性升高。ACSS2可能通過調控NF-κB信號通路及Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白的表達提高MGC80-3細胞的DDP敏感性。ACSS2可能通過參與NF-κB活化及下游凋亡相關蛋白表達來調控胃癌細胞DDP敏感性，但其具體作用機制尚有待于進一步研究。