Flotillin-1在結腸癌中表達的初步研究

張暢 ，張佩云 ，鞠九妹 ，楊鎮旗 ，方錦玲 ，鐘鳳梅 ，方賢磊 ，謝柳

1.湖南醫藥學院醫學院，湖南懷化 418000；2.湖南醫藥學院第一附屬醫院病理科，湖南懷化 418000

結腸癌（colorectal cancer）是常見的消化系統的惡性腫瘤，僅次于胃癌和食管癌[1]。在我國，因惡性腫瘤死亡原因中，男性排在第五位，女性排在第6位，且近20年間發病率逐漸上升，男女比例約為2∶1[2]。其病因可能涉及環境因素、化學致癌物作用及基因的遺傳和表觀遺傳學變異等多個因素。

Flotillins/Reggies家族最早發現于金魚視網膜神經節細胞中，是一類高度保守并廣泛表達的蛋白，在果蠅和人等多種生物中存在，有兩個成員，分別為Flotillin-1（Flot1）和 Flotillin-2（Flot2）[3]。Flotillins蛋白主要定位于細胞膜胞質側，同時廣泛存在于多個細胞器內，不含跨膜結構域，通過豆蔻酰化和多個位點的棕櫚酰化與細胞膜內側相連[4]。Flotillins蛋白是細胞膜的重要組成部分，存在于細胞膜的脂筏結構上，參與跨膜物質轉運、軸突再生、淋巴細胞分化和維持脂筏及細胞粘附等多種生理功能[5-6]。大量的研究發現Flotillins作為脂筏上的支架蛋白，參與多種信號通路的調節，且在多種腫瘤中高表達。曹傳林等[7]收集了2015年5月手術的16例新鮮胃癌及癌旁組織標本，發現Flot1在RNA和蛋白水平均表達上調；2007年1月—2008年6月手術的187例石蠟標本，Flot1也表達上調，且與腫瘤浸潤、淋巴結轉移和臨床分期有關[7]。Ou YX等[8]總結了包括2 473各病例的13項研究結果，發現Flot1在各種實體腫瘤中表達與腫瘤的進展和患者的預后相關。Yang Q等[9]則發現細胞骨架蛋白4.1N可以通過抑制Flot1/β-catenin/Wnt信號通路抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和轉移，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從該院病例中選取結腸癌病例34例，非腫瘤性結腸疾病病例14例手術標本，該研究經過湖南醫藥學院第一附屬醫院倫理委員會批準，患者或家屬知情同意。其中男性33例，女性15例，平均年齡55.7歲（44～78歲）。根據術后病理診斷及是否有淋巴結轉移，分為非腫瘤組14例，結腸癌無淋巴結轉移組21例（簡稱非轉移組），結腸癌發生淋巴結轉移組13例（簡稱轉移組）。所有標本經10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，連續切片，制成4 μm厚切片備染。

1.2 免疫組化染色

應用免疫組化SP法進行檢測，所采用的試劑Flotillin-1多克隆抗體購自proteintech公司、枸櫞酸鹽抗原修復液（pH6.0）、DAB顯色液及PBS緩沖液均購自邁新公司。每個組織切片，經脫蠟、枸櫞酸鹽抗原修復液熱修復，過氧化氫、牛奶封閉后滴加一抗（1∶200）4℃過夜。 復溫后滴加二抗，37℃孵育 30 min，滴加HRP標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育3 min，最后DAB顯色，蘇木精復染，中性樹脂封片。

1.3 結果判定

每張切片隨機選取10個40×10倍視野，每個視野計數100個腺上皮細胞，取平均值。Flotillin-1主要位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色。陽性細胞比例=0%，1%～5%，6%～15%，＞15%，分別為“-，+，++，+++”。 結果統計時，以“-”和“+”為低表達，“++”和“+++”為高表達。

1.4 統計方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理。計數資料[n（%）] 采用 χ2檢驗和 Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Flotillin-1在結腸癌病例中高表達

在34例結腸癌組織中，Flotillin-1的陽性高表達率為58.8%（20/34）。在14例非腫瘤性結腸疾病標本中，Flotillin-1 的陽性高表達率為 14.3%（2/14）。Flotillin-1主要表達在結腸腺癌細胞的細胞膜和細胞質中，呈淺黃色或棕黃色（圖1）。統計分析Flotillin-1在結腸癌和非結腸癌標本中的表達差異有統計學意義（P<0.05）（表 1）。

2.2 Flotillin-1與結腸癌淋巴結轉移密切相關

圖1 結腸癌與非結腸癌標本中Flot1表達

表1 結腸癌與非結腸癌中Flot1表達

在34例結腸癌組織中，分為非轉移組21例和轉移組13例。其中非轉移組中，Flotillin-1在癌組織中陽性高表達率為38.1%（8/21）（圖2），淋巴結中陽性高表達率為0.0%（0/21）；轉移組中，Flotillin-1在癌組織中陽性高表達率為92.3%（12/13），淋巴結（轉移癌巢）中陽性高表達率為76.9%（10/13）（圖3）。采用Fisher確切概率法檢驗分析Flotillin-1在發生淋巴結轉移的結腸癌和未發生淋巴結轉移的結腸癌標本中的表達差異有統計學意義（P<0.05）（表2,3）。

圖2 轉移組與未轉移組癌組織中Flot1表達

表2 轉移組與非轉移組癌組織中Flot1表達

圖3 轉移組與未轉移組淋巴結中Flot1表達

表3 轉移組與非轉移組淋巴結中Flot1表達

3 討論

結腸癌由于早期癥狀不明顯，起病隱匿，多數患者發現是已經是中晚期，部分甚至已經出現遠處轉移，喪失了手術治療的最佳時期，導致患者的預后較差。因此，需要對結直腸癌轉移的具體機制進行深入的研究并探究其具體機制，尋找有效的靶向藥物作用位點。

該文結腸癌組織中Flotillin-1高表達的陽性率為 58.8%，顯著高于非結腸癌病例的 14.3%（χ2=7.923，P<0.05），表明Flot1在結腸癌組織中與正常結腸上皮中表達有顯著差異，提示了Flotillin-1在結腸癌患者中高表達，可能與結腸癌的發生、發展存在相關性。同時，該文還比較了發生淋巴結轉移的結腸癌病例和未發生淋巴結轉移的結腸癌病例的癌組織和淋巴結中Flotillin-1的表達，發現在發生淋巴結轉移的結腸癌病例中，Flotillin-1在癌組織中的高表達率為92.3%，淋巴結（轉移癌巢）中高表達率為76.9%，在非轉移的結腸癌組織中高表達率為38.1%，淋巴結中無表達，經Fisher確切概率法統計兩組數據均有明顯差異。提示Flotillin-1與結腸癌的淋巴道轉移有相關性。而在其他惡性腫瘤中，也發現Flotillin-1存在高表達并與轉移相關。Li J等[10]發現Flotillin-1在多種上皮性腫瘤中表達升高，其中惡性腫瘤81.48%表達上調，交界性腫瘤也有50%。Guo AY等的研究則提示Flotillin-1在肺腺癌高表達并在肺腺癌的發生、發展中有重要作用，干擾Flot1的表達可以明顯抑制肺腺癌細胞向惡性表型發展[11]。Li Y等[12]則發現Flotillin-1在乳腺癌細胞系MCF-7中與AdipoR1相互作用共同介導癌細胞的遷移。上述學者的研究及該文的研究均提示Flot1在各型腫瘤，尤其是惡性腫瘤中表達升高，并與腫瘤的發生、發展、轉移和轉歸密切相關。

綜上所述，Flotillin-1在結腸癌中高表達并與結腸癌的淋巴結轉移密切相關，可以將其作為反映結腸癌病情嚴重程度的指標，未來也有潛力作為靶向治療結腸癌的靶標之一。