基于Rho/Rock通路當歸紅芪多糖對H9C2細胞放射性心肌損傷的影響

蔣虎剛 馮明霞 劉凱 任春貞 紀召娟 趙信科 李應東

摘要：目的 ?基于Rho/Rock通路觀察當歸紅芪多糖對H9C2細胞放射性損傷的影響，探討其干預放射性心肌損傷作用機制。方法 ?將細胞隨機分為空白組（不干預）、模型組（2 Gy X線照射并予生理鹽水干預）、陽性對照組（2 Gy X線照射并予陽性藥干預）和中藥低、中、高劑量組（2 Gy X線照射并予當歸紅芪多糖干預），ELISA檢測細胞超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）的表達，RT-PCR檢測各組細胞一氧化氮合酶（iNOS）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、Rhoa、Rock mRNA的表達，Western blot檢測細胞誘導型iNOS、eNOS、Rhoa、Rock蛋白的表達，流式細胞術檢測細胞凋亡。結果 ?與空白組比較，模型組細胞SOD、GSH、eNOS蛋白及eNOS mRNA表達下調，MDA、iNOS、RhoA、Rock蛋白及iNOS、RhoA、Rock mRNA表達上調，細胞發生凋亡;與模型組比較，藥物干預組細胞SOD、GSH、eNOS蛋白及eNOS mRNA表達上調，MDA、iNOS、RhoA、Rock蛋白及iNOS、RhoA、Rock mRNA表達下調，細胞凋亡減少。結論 ?當歸紅芪多糖可通過抑制氧化應激、Rho/Rock通路活化、細胞凋亡等干預放射性心肌損傷。

關鍵詞：當歸紅芪多糖;氧化應激反應;Rho/Rock通路;細胞凋亡

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0054-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.012 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To investigate the effects of polysaccharide from Angelicae Sinensis Radix and Hedysari Radix on H9C2 cells injured by radiation based on Rho/Rhck pathway; To discuss its mechanism ofinterfere with radiation-induced heart disease （RIHD）. Methods The cells were randomly divided into blank group （no intervention）， model group （2 Gy X-ray irradiation and physiological saline intervention）， positive control group （2 Gy X-ray irradiation and positive medicine intervention）， and TCM low-， medium- and high-dosage group （2 Gy X-ray irradiation and intervention with polysaccharide from Angelicae Sinensis Radix and Hedysari Radix）. The expressions of SOD， MDA and GSH were detected by ELISA. The QT-PCR method was used to detect the expressions of iNOS， eNOS， RhoA and Rock mRNA， and the expressions of iNOS， eNOS， RhoA and Rock protein were detected by Western blot. The apoptosis of each group was detected by flow cytometry. Results Compared with the blank group， the expressions of SOD， GSH， eNOS protein and eNOS mRNA were down-regulated in the model group， and the expressions of MDA， iNOS， Rhoa， Rock protein and iNOS， RhoA， Rock mRNA were up-regulated， and cells were under apoptosis. Compared with the model group， the expressions of SOD， GSH， eNOS protein and eNOS mRNA were up-regulated， and the expressions of MDA， iNOS， RhoA， Rock protein and iNOS， RhoA and Rock mRNA were down-regulated， and apoptosis was alleviated in medicine intervention groups. Conclusion Polysaccharide from Angelicae Sinensis Radix and Hedysari Radix can interfere with RIHD by inhibiting oxidative stress， activation of Rho/Rock pathway， and apoptosis.

Keywords： polysaccharide from Angelicae Sinensis Radix and Hedysari Radix; oxidative stress; Rho/Rock pathway; apoptosis

胸腔惡性腫瘤放射治療及心臟介入手術的廣泛開展，不可避免造成放射性心肌損傷（radiation- induced heart disease，RIHD）[1]。射線劑量的增加是提高放療效果的重要手段之一，RIHD限制放射劑量的提高使其療效減低，但RIHD亦是慢性心力衰竭的重要病因之一[2]。研究發現，RIHD表現為心臟的遲發應激反應，其后期心臟組織最主要的病理改變是心肌纖維化[3-4]，而纖維化是一種不可逆的病理改變。目前對RIHD發病機制、干預措施尚無統一的認識，但有研究結果表明，RIHD可能與Rho/Rock信號通路關系密切，同時Rho/Rock信號通路與細胞的炎癥反應、氧化應激、凋亡等亦存在著緊密聯系[5]。因此，基于Rho/Rock信號通路探討RIHD的發病機制、防治策略具有客觀基礎。研究表明，當歸紅芪多糖成分有清除自由基、抗氧化、抗炎等作用[6-7]，但其防治RIHD的機制、療效尚未明確。因此，本研究以Rho/Rock信號通路為中心，采用ELISA、QT-PCR、Western blot、流式細胞術等手段探討氧化應激、Rho/Rock通路活化、細胞凋亡之間的關系，進一步揭示RIHD發病機制及當歸紅芪多糖的干預作用，為防治RIHD及早期預防心力衰竭提供依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?細胞

H9C2細胞由甘肅中醫藥大學中西醫結合研究所提供，經劉凱副教授鑒定為正常H9C2細胞。

1.2 ?藥物與試劑

當歸紅芪多糖為本課題組前期分離所得[6-7]，批號2016-06-3;硫辛酸，批號20161012013F，上海士鋒生物科技有限公司;法舒地爾，批號I10428-201601，南京萊富賽生物科技有限公司;兔抗誘導型一氧化氮合酶（iNOS）抗體、兔抗內皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體、兔抗RhoA抗體、兔抗Rock抗體，上海康朗生物科技有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒，南京建成生物化學試劑有限公司;總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒，上海吉瑪制藥技術有限公司;Annexin Ⅴ-FITC試劑盒，德國Miltenyi Biotec公司。

1.3 ?儀器

超凈工作臺、Eppendorf移液槍、二氧化碳培養箱、酶標儀，Thermo公司;實時定量PCR儀、核酸蛋白濃度測定儀，BIO-RAD公司;高速低溫離心機，Sigma公司;精密電子天平，OHAUS公司;流式細胞儀，Becton Dickinson公司。

1.4 ?造模

本課題組前期研究發現，2 Gy輻射劑量為建立RIHD細胞模型的最佳輻射劑量，同時參考相關文獻輻射劑量[8-9]，因此本研究采用2 Gy輻射劑量X線照射建立RIHD模型。

1.5 ?干預

將細胞隨機分為空白組（不干預）、模型組（2 Gy X線照射并予生理鹽水干預）、陽性對照組（2 Gy X線照射并予0.2 mmol/L硫辛酸或0.1 mmol/L法舒地爾溶液干預）和中藥低、中、高劑量組（2 Gy X線照射并分別予當歸紅芪多糖0.1、0.2、0.4 g/L干預）。上述給藥均為單次給藥，給藥體積均為0.2 mL，給藥時間均為模型建立完成后，檢測時間為給藥后24 h。

1.6 ?指標檢測

SOD、MDA、GSH檢測時嚴格按ELISA試劑盒說明書進行，主要步驟包括：加樣0.1 mL樣本后37 ℃孵育1 h，洗滌3次后滴加酶標抗體0.1 mL，37 ℃孵育1 h，洗滌后加顯色液0.1 mL，37 ℃孵育30 min，最后終止反應并檢測。PCR檢測時根據總RNA提取試劑盒說明書提取細胞中總mRNA，并根據表1要求配制反轉錄體系。反轉錄程序：25 ℃、5 min，42 ℃、60 min，70 ℃、10 min，4 ℃保存。擴增體系見表2。擴增程序反應設置：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。檢測細胞mRNA的表達，引物序列見表3。Western blot檢測時依次提取制備蛋白樣品、配制凝膠、電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光，濃縮膠電泳（80 V），分離膠電泳（120 V），轉膜（80 V、120 min），采用Bio-RAD檢測條帶，并用Bio-RAD Quantityone圖像分析軟件檢測;流式細胞術檢測細胞凋亡，按Annexin Ⅴ-FITC試劑盒說明書進行。

1.7 ?統計學方法

采用SPPS24.0統計軟件進行分析。實驗結果以±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 ?結果

2.1 ?ELISA檢測結果

與空白組比較，模型組細胞SOD、GSH表達明顯下調（P<0.01），MDA表達明顯上調（P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組細胞SOD、GSH表達明顯上調（P<0.01），MDA表達明顯下調（P<0.01）;中藥低劑量組SOD、GSH表達上調，MDA表達無改變;中藥中劑量組細胞SOD、GSH表達明顯上調（P<0.05），MDA表達明顯下調（P<0.01）;中藥高劑量組細胞SOD、GSH表達明顯上調（P<0.05，P<0.01），MDA表達明顯下調（P<0.01）。結果見表4。

2.2 ?RT-PCR檢測結果

與空白組比較，模型組細胞iNOS、RhoA、Rock mRNA表達明顯上調（P<0.05），eNOS mRNA表達明顯下調（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組細胞iNOS、RhoA、Rock mRNA表達明顯下調（P<0.01），eNOS mRNA表達明顯上調（P<0.01）;中藥低劑量組細胞iNOS mRNA表達明顯下調（P<0.05），eNOS、RhoA mRNA表達無改變（P>0.05）;中藥中劑量組細胞iNOS、RhoA、Rock mRNA表達明顯下調（P<0.05，P<0.01），eNOS mRNA表達無改變（P>0.05）;中藥高劑量組細胞iNOS、RhoA、Rock mRNA表達明顯下調（P<0.05，P<0.01），eNOS mRNA表達明顯上調（P<0.05）。結果見表5。

2.3 ?Western blot檢測結果

與空白組比較，模型組細胞iNOS、RhoA、Rock蛋白表達明顯上調（P<0.05），eNOS蛋白表達明顯下調（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組細胞iNOS、RhoA、Rock蛋白表達明顯下調（P<0.01），eNOS蛋白表達明顯上調（P<0.05）;中藥低劑量組細胞iNOS、Rock蛋白表達明顯下調（P<0.05，P<0.01），eNOS、RhoA蛋白表達無改變（P>0.05）;中藥中劑量組細胞RhoA、Rock、iNOS蛋白表達明顯下調（P<0.05，P<0.01），eNOS蛋白表達無改變（P>0.05）;中藥高劑量組細胞iNOS、RhoA、Rock蛋白表達明顯下調（P<0.05，P<0.01），eNOS蛋白表達明顯上調（P<0.05）。結果見表6、圖1。

2.4 ?流式細胞儀檢測結果

與空白組比較，模型組早、晚期凋亡細胞比例均明顯增高（P<0.05，P<0.01），正常細胞比例明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組晚期凋亡細胞比例明顯降低（P<0.01），早期凋亡細胞比例明顯降低（P<0.05），正常細胞比例明顯升高（P<0.01）;中藥低劑量組早、晚期凋亡細胞比例無明顯降低（P>0.05），正常細胞比例無明顯升高（P>0.05）;中藥中劑量組晚期凋亡細胞比例明顯降低（P<0.05），早期凋亡細胞比例無明顯降低（P>0.05），正常細胞比例明顯升高（P<0.05）;中藥高劑量組早、晚期凋亡細胞比例均明顯降低（P<0.05，P<0.01），正常細胞比例明顯升高（P<0.01）。見表7、圖2。

3 ?討論

3.1 ?放射性心肌損傷氧化應激反應與Rho/Rock通路活化

本研究發現模型組細胞SOD、GSH的表達顯著升高而MDA的表達明顯降低，同時Rho/Rock通路明顯活化，表明RIHD時細胞發生明顯的氧化應激與Rho/Rock通路活化，但關于RIHD時氧化應激與Rho/Rock通路活化的關系尚不明確。因此本研究采用硫辛酸干預RIHD氧化應激后比較Rho/Rock通路活化水平，發現抑制氧化應激后Rho/Rock通路活化明顯受到抑制，表明氧化應激是Rho/Rock通路活化的上游信號。本研究還發現，當歸紅芪多糖干預氧化應激并抑制Rho/Rock通路活化時具有劑量依賴性，高劑量當歸紅芪多糖對氧化應激及Rho/Rock通路活化具有明顯的抑制作用。通過比較當歸紅芪多糖各組SOD、MDA、GSH的水平發現，當歸紅芪多糖對SOD、MDA較GSH具有更為明顯的調節作用。GSH是自身合成的一種非酶性抗氧化劑，可作為細胞內蛋白質合成、能量代謝等多種代謝活動的供氫體;在參與抗氧化反應時，其可通過自身巰基與氧自由基等結合及復活已被滅活的巰基酶而減少氧自由基對細胞膜中含巰基的蛋白的破壞;細胞凋亡早期，在巰基轉移酶的調節下GSH維持半胱氨酸的還原狀態而使其自身水平降低，可作為氧化應激導致細胞凋亡的早期信號[10-11]。因此，推測本研究中當歸紅芪多糖對GSH表達調節作用較弱的可能機制為當歸紅芪多糖能更為廣泛的抑制氧化應激、減少氧自由基生成而減少GSH的消耗。

3.2 ?Rho/Rock通路活化與細胞凋亡

本研究發現模型組細胞早、晚期凋亡細胞比例明顯升高，且正常細胞比例明顯降低，表明細胞發生明顯凋亡，而細胞凋亡與Rho/Rock通路活化的相關性尚不明確。因此，本研究通過法舒地爾抑制Rho/Rock通路活化后檢測細胞的凋亡變化，發現抑制Rho/Rock通路活化后細胞凋亡明顯減輕，表明細胞凋亡是Rho/Rock通路活化的下游信號。通過通過比較當歸紅芪多糖各組細胞凋亡水平發現，低劑量當歸紅芪多糖無調節細胞凋亡作用;中劑量當歸紅芪多糖可調節細胞晚期凋亡及正常細胞水平，而無調節早期凋亡作用;高劑量當歸紅芪多糖可調節細胞早、晚期凋亡及正常細胞水平，表明中、高劑量當歸紅芪多糖可明顯調節細胞凋亡。研究表明，Caspase-3是一種潛在的Rock激動劑，可破壞Rock分子的自身折返并暴露其活化中心，而活化的Rock可激活Caspase-3，并使其自身裂解產生Rock，因此，Rock既是Caspase-3的激動劑又是其活化產物[12-13]。推測當歸紅芪多糖通過抑制Rho/Rock通路活化減少凋亡蛋白Caspase-3的表達而抑制細胞凋亡，同時Caspase-3表達的減低又可抑制Rho/Rock通路活化，從而形成良性循環，進一步干預RIHD時Rho/Rock通路活化與細胞凋亡，并干預RIHD。

綜上所述，高劑量X線輻射可致細胞氧化應激后激活Rho/Rock通路并進一步誘導細胞凋亡，而當歸紅芪多糖可通過抑制氧化應激、Rho/Rock通路活化、細胞凋亡3條途徑干預RIHD。本研究通過探討RIHD的發病機制及當歸紅芪多糖干預RIHD的作用機制，為突破放療瓶頸、防治RIHD及早期預防心力衰竭提供依據。

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（收稿日期：2018-10-10）

（修回日期：2018-10-25;編輯：華強）