BCL2-938C>A基因多態性與兒童急性淋巴細胞白血病危險度的相關性研究*

黃體龍，李曾麗，桑寶華，雷慶齡，宋春艷，楊春會，林云碧，呂 瑜，田 新，楊躍煌

(云南省昆明市兒童醫院血液科 650228)

兒童血液系統惡性腫瘤以急性淋巴細胞白血病(ALL)最常見，每年發病率3/10萬～4/10萬，多見于學齡前期和學齡期兒童。兒童ALL分低、中、高危組，不同危險度ALL的治療強度不同、預后不同。危險度分級由多種預后危險因素綜合評估。隨著危險度分組的不斷精確和治療方案的不斷改進，兒童ALL的治愈率在近半個世紀來得到了顯著的提高，目前化療可以使兒童ALL的5年總生存率(OS)超過80%[1-2]。然而，長期化療會引起嚴重的不良反應，尤其對高危患者而言，高強度的化療不良反應更加嚴重[3]。因此，不斷發掘新的預后因素、進一步精確危險度分級，制定更加合理有效的化療方案是提高ALL患兒治愈率，減少不良反應的關鍵。

1984年TSUJIMOTO等首次在濾泡性淋巴瘤患者的腫瘤細胞中發現位于18號和14 號染色體(t14；18)易位連接處的BCL2基因。BCL2基因能夠促進細胞生長、抗細胞凋亡[4]。BCL2基因位于18號染色體長臂2區1帶(18q21)，含3個外顯子和2個啟動子，其編碼產物為1個由239個氨基酸組成的膜蛋白[5]。已有多篇文獻報道BCL2-938 C>A與癌癥易感性和預后相關[6-7]。本文旨在研究BCL2-938 C>A基因多態性在兒童ALL危險度分組及治療分層中的意義，以使危險度分組更加精確，進一步提高兒童ALL的治愈率、減少過度治療及治療相關的不良反應。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2007年5月至2017年1月昆明市兒童醫院血液科診斷和治療的69例ALL兒童作為研究對象，69例患兒均按照細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學分型(MICM)確診，并排除其他惡性腫瘤。按CCLG-ALL-2008方案進行危險度分組及治療[8]。本研究經昆明市兒童醫院倫理委員會批準且患兒家屬均簽署知情同意書。69例ALL患兒中，男42例，女27例；初診年齡0.8～12.9歲，平均為(5.8±3.2)歲；隨訪時間為2～117個月，中位隨訪時間為15個月。其中低危組28例，中危組20例，高危組21例；B系急性淋巴細胞白血病(B-ALL)55例，急性T淋巴細胞白血病(T-ALL) 14例；55例患兒初發白細胞計數(WBC)為0～50×109/L,14例在50×109/L以上。檢測到分子遺傳學改變有19例，包括5例Ph陽性(其中1例BCR/ABL陽性同時伴有IKZF1基因缺失)，9例TEL/AML1融合基因陽性，3例SIL/TAL1陽性，1例ASSI基因缺失，1例有MYC基因分離重排。復發8例，其中骨髓復發5例，髓外復發3例。死亡4例，放棄治療1例。

1.2儀器與試劑 PCR儀(美國ABI，GeneAmp?9700 384 Dual)；點樣儀(美國Agena，MassARRAY Nanodispenser RS1000)；質譜分析儀(美國Agena，MassARRAY Compact System)。主要試劑：血液基因組提取試劑盒(中國天根Tiangen，DP319)；基因分型試劑盒(美國Agena，Complete Genotyping Reagent Kit，10148-2)。

1.3方法

1.3.1標本的采集與保存 留取初診ALL患兒的骨髓1.5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2基因組DNA的提取和SNPs分型

1.3.2.1從患兒EDTA抗凝骨髓1.5 mL中提取DNA，紫外分光光度法檢測OD260/OD280。

1.3.2.2PCR擴增及純化目的基因檢測位點為rs2279115，根據SNP位點使用Agena公司的Assay Design 3.1軟件進行引物設計并用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)對合成的引物進行質檢。PCR反應體系(5 μL)：去離子水1.8 μL，正向與反向引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL,10×buffer液0.5 μL，Mg2+0.4 μL，dNTP 0.1 μL，Hotstar 0.2 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共45個循環；最后72 ℃延伸5 min。SAP酶消化非特異性產物。

1.3.2.3單堿基延伸反應延伸反應體系(2 μL)：0.619 μL水，10×iplex buffer 0.2 μL,Terminator mix 0.2 μL,引物0.94 μL,單堿基延伸酶0.041 μL。循環條件：94 ℃ 30 s,94 ℃ 5 s,52 ℃ 5 s,80 ℃ 5 s，內部5個循環,共45個循環，72 ℃ 3 min結束。在每個延伸反應物加入樹脂35 min，脫鹽；將脫鹽后的樣品點樣在樣品靶上，自然結晶。

1.3.2.4MALDI-TOF-MS分型檢測時向延伸反應產物的384孔板中加入16 μL三蒸餾水，在離心機中以2 000 r/min離心3 min；加入樹脂，在反向搖勻儀上做樹脂純化反應35 min，脫鹽；反應完成后，在離心機中以2 000 r/min離心3 min；將脫鹽后的樣品點樣在樣品靶上，自然結晶。用Typer 4.0軟件檢測質譜峰，并根據質譜峰圖鑒定各樣本靶位點基因型。Mass Array?SNP檢測SNP多態性，用MALDI-TOF-MS檢測延伸產物的相對分子質量，分析軟件Mass Array TYPER 4.0 進行基因分型分析。

2 結 果

2.1BCL2-938 C>A基因型分布特點 C等位基因在這個樣本中的頻率為0.53，A等位基因的頻率為0.47，基因型分布情況符合Hardy-Weinberg平衡。69例ALL兒童BCL2-938 C>A基因型的檢測結果顯示，CC基因型有23例，CA型27例，AA型19例，見表1。

表1 BCL2-938C>A基因型與臨床危險因素

2.2BCL2-938C>A基因型與臨床危險因素相關性 ALL患兒預后與發病年齡(1～≤10歲或>10歲)、初發外周血白細胞計數(≥50×109/L)、免疫表型(T-ALL)、預后不良的分子遺傳學改變(BCR-ABL融合基因等)、早期治療反應不良(D15及D33MRD未緩解)等危險因素有關。本研究提示BCL2-938C>A基因型與兒童ALL危險因素差異無統計學意義，包括患兒的發病年齡、免疫表型、分子遺傳學改變、初發外周血白細胞計數、早期治療反應不良，見表1。

表2 BCL2-938基因型與不同危險度ALL的相關性

2.3BCL2-938基因型多態性與ALL的危險度相關性 不同BCL2-938基因型間ALL的危險度差異有統計學意義(P=0.015)，見表1。CC基因型患兒的百分比在低危(14.3%)、中危(40.0%)、高危組(52.4%)中呈逐漸上升趨勢。攜帶CC基因型ALL患兒出現在中高危組的頻率較CA/AA基因型患兒高。CC基因型的ALL患兒比CA/AA基因型患兒有更高風險分布于中、高危組(P<0.05)，見表2。

3 討 論

兒童急性淋巴細胞白血病的治療是一個漫長且復雜的過程，包括早期誘導治療、鞏固治療和繼續治療3個階段。早期的誘導治療是為了減少腫瘤細胞的負荷并恢復骨髓正常的造血功能，是決定患兒能否獲得長期無病生存的關鍵。鞏固治療的目的是進一步清除誘導治療后殘留的白血病細胞。繼續治療包括再誘導治療及為期2～3年的維持治療，目的在于防止白血病在誘導、鞏固、緩解后出現復發。在過去20年中，ALL兒童生存率得到了顯著改善，這歸功于危險度分組的不斷完善及化療方案的不斷改進。兒童ALL危險度分組的不斷精確，得益于人們對ALL細胞遺傳學及其他生物學特征等遺傳相關預后因素的不斷發現、認識及利用[9]。兒童ALL分為低、中、高危險度組，不同危險度給予不同的治療強度[10]。低危患兒通常預后較好，予以低強度的化療方案就可達到長期無病生存，而相對預后較差的中高危組患兒需要更高強度的化療來避免復發。分層治療使得高危患者接受更強的治療以尋求長期無病生存，讓不存在高危因素的患兒治療強度降低，從而避免過度治療、減少化療相關不良反應的發生。

BCL2是在調節細胞凋亡和延遲細胞周期中起重要作用的抗凋亡蛋白[11]。目前BCL2基因啟動子區域僅有1個SNP，其位于核苷酸-938位置(BCL2-938 C>A)。有研究表明，BCL2-938 C>A啟動子多態性顯著影響了多種癌癥的BCL2基因啟動子活性及BCL2的表達[12-13]。BCL2-938 C>A多態性與不同類型癌癥的風險關聯不同，這取決于組織細胞的特異性。LIU等[14]發現BCL2-938 AA基因型與食管癌的易感性有關；LI等[15]的研究顯示BCL2-938 CC基因型會導致人群罹患食管癌及其癌前病變的風險增加。有文獻[16]報道BCL2在成年ALL的誘導治療期間是一個潛在的治療反應指標。本文研究了BCL2-938 C>A多態性與ALL危險度的關系，發現基因多態性與兒童ALL的危險度分組密切相關，CC基因型ALL患兒出現在中高危組的頻率更高。此外，本文研究了BCL2-938 C>A基因多態性與目前兒童ALL常見的危險因素相關性，發現BCL2-938 C>A基因型與發病年齡、初發白細胞計數、分子遺傳學改變、D15及D33 MRD等危險因素無明顯相關性。本研究提示CC基因型可能是兒童ALL危險分組的重要因素。

綜上所述，BCL2-938 C>A基因多態性與兒童ALL的危險度分組密切相關，BCL2-938 CC基因型可能是兒童ALL重要的危險因素。在兒童ALL中，BCL2-938 C>A基因多態性的表達可能有利于精確危險度分組及進一步指導臨床治療。