白僵菌誘導甘草氣孔關閉的信號機制研究

高 靜,王 楠，關思靜，沈 霞，胡本祥，顏永剛，張 崗

(1.陜西中醫藥大學 藥學院，陜西 西安 712046；2.陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西 咸陽 712000)

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)是國家二類保護植物，又稱國老、烏拉爾甘草、甜根子等，屬于豆科、甘草屬多年生深根性植物，廣泛用于醫藥、食品和化妝品等領域[1]，多分布在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠邊緣和黃土丘陵地帶[2]，水分是限制甘草生長的重要因素，而植物體吸收的水分超過90%都通過氣孔散失到大氣中。氣孔的開閉運動對外界環境變化極其敏感，干旱、CO2濃度、光照、光質、溫濕度、植物激素和微生物等都能影響氣孔開閉[3]。近些年來，氣孔的運動機理研究十分深入，活性氧(ROS)、NO、Ca2+、MAPK、K+和胞質pH等都參與了保衛細胞的信號傳導過程，微生物誘導的氣孔開閉運動也是近幾年研究的熱點之一[3～4]。

白僵菌(Beauveriabassiana)屬于半知菌綱鏈孢霉目鏈孢霉科，是一種真菌性殺蟲劑，對人、畜無毒，對作物安全，無殘留、無污染。探究白僵菌對氣孔的影響，有利于深入理解氣孔運動信號轉導機制，為通過降低植物因蒸騰作用散失的水分，提高植物對水分的利用率提供理論指導依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

將甘草種子消毒，5%次氯酸鈉滅菌15 min，無菌水沖洗3次后，放入光照培養箱(25℃，光周期16 h/8 h)催芽一周，然后播種在營養土中，溫室培養，適當澆水，保持土壤濕潤。

1.2 實驗試劑

KCl、CaCl2、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、水楊羥肟酸(SHAM)、咪唑和氯化鈷(CoCl2)均為國產分析純，購自上海源葉生物技術有限公司。白僵菌孢子粉購于山東綠隴生物科技有限公司，有效菌含量為1 000億·g-1。

1.3 實驗方法

1.3.1 誘導氣孔關閉試驗 選擇生長良好的10～12周齡的甘草植株，取頂端的第二片完全展開的葉片，用鑷子輕輕撕取下表皮，放入MES-KCl(MES 10 mM，KCl 50 mM，CaCl2 100 μM pH 6.15)緩沖液中。充分光照處理2 h，使氣孔完全打開，取部分表皮條，用不同孢子濃度(0.01 g·mL-1、0.02 g·mL-1、0.04 g·mL-1、0.1 g·mL-1)白僵菌處理，繼續充分光照1 h后于顯微鏡下拍照記錄。

1.3.2 抑制劑處理的表皮條實驗 取充分光照處理的表皮條轉入含有信號抑制劑EGTA(2 mM)、咪唑(20 mM)、GSH(2 mM)、SHAM(2 mM)和CoCl2(10 mM)的MES-KCl緩沖液中，并在光下繼續照射0.5 h。再將抑制劑處理過的表皮條移入孢子濃度0.1 g·mL-1的白僵菌溶液中光照1 h 后于顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.4 氣孔開度測量和數據統計

每個實驗處理隨機取三個視野，每個視野隨機選取10個氣孔進行測量。每個處理重復三次，取3次重復的平均值和標準誤差，用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics, Silver Springs, MD)測定線段的方法測量氣孔開度。使用 Spss 20.0 軟件進行數據分析，所有數據圖均由Excel完成。

2 結果

2.1 白僵菌誘導甘草表皮氣孔關閉

如圖1所示，在經過充分的光照后，甘草表皮氣孔完全打開，MES緩沖液中氣孔開度達到了11.05 μm。在用白僵菌處理1 h后，氣孔開度明顯下降，0.01 g·mL-1、0.02 g·mL-1、0.04 g·mL-1、0.1 g·mL-1分別使氣孔開度與對照相比下降了30.4%、26.6%、36.5%和35.8%。圖 2是白僵菌促進甘草氣孔關閉的時間動態變化。在時間效應方面，施用白僵菌之后甘草的氣孔開度逐漸變小，處理2 h氣孔開度最小。

2.2 ROS在白僵菌對甘草葉片氣孔開度影響中的作用

圖1 不同濃度白僵菌誘導的氣孔關閉

圖2 白僵菌誘導氣孔關閉的時間動態變化

如圖3所示，NADPH氧化酶抑制劑(咪唑)、ROS清除劑(GSH)和細胞壁過氧化物酶抑制劑(SHAM)單獨處理對甘草氣孔開度影響不大。咪唑、GSH、SHAM與白僵菌共處理后，都抑制了白僵菌誘導的氣孔關閉，經過咪唑、GSH和SHAM處理后，白僵菌處理的表皮條氣孔開度分別恢復到對照組的112.8%、90.8%和106.6%。

2.3 Ca2+和乙烯在白僵菌對甘草葉片氣孔開度影響中的作用

圖3 活性氧參與白僵菌誘導的氣孔關閉

由圖4和5所示，鈣離子螯合劑(EGTA)和ACC氧化酶抑制劑(CoCl2)單獨處理對甘草氣孔開度影響不大，經過EGTA、CoCl2和白僵菌共處理后，使甘草的氣孔開度分別恢復到對照組的104.4%和92.9%。

圖4 Ca2+參與白僵菌誘導的氣孔關閉

圖5 乙烯參與白僵菌誘導的氣孔關閉

3 討論

氣孔由一對保衛細胞組成，是聯接植物與外界氣體和水分交換的重要通道[5]，先前認為它是病原微生物進入植物體內的開口，后來的研究證明，氣孔遇到微生物會選擇性主動關閉，是先天免疫的一部分[3～4]。酵母、大腸桿菌及其激發子類物質(殼聚糖、脂多糖、葡聚糖、幾丁質)等都可通過ROS爆發、Ca2+、NO等信號物質誘導氣孔關閉[3～4]。筆者的研究表明白僵菌可以促進甘草氣孔關閉，可以作為抗蒸騰劑的候選材料。

氣孔調控是一個非常復雜的過程，涉及多種信號物質傳遞過程。ROS信號與氣孔開閉緊密相關，其種類包括超氧陰離子自由基、H2O2、單線態氧、羥自由基和氫過氧自由基等[6]。植物細胞產生ROS的途徑很多，光合電子傳遞過程、葉綠體、過氧化物體和線粒體等都可在代謝過程中產生ROS，黃嘌呤氧化酶、細胞壁過氧化物酶和質膜DAPDH氧化酶等多種酶類參與ROS的產生[3,6]。脫落酸(ABA)誘導氣孔關閉過程中ROS的來源之一就是NAPDH氧化酶，ABA刺激細胞產生ROS，ROS隨后誘導NO產生及激活質膜Ca2+通道，改變胞內Ca2+濃度，最終導致氣孔關閉[4,6]。筆者研究中咪唑和EGTA分別是NADPH氧化酶抑制劑和鈣離子螯合劑，都可以逆轉白僵菌誘導的氣孔關閉，由此推測NADPH氧化酶產生的H2O2參與白僵菌誘導的氣孔關閉過程，Ca2+作為第二信使也發揮了重要作用。

乙烯是重要的生長調節劑，控制植物對抗逆境及果實成熟等重要生理過程，ACC氧化酶是其合成途徑中的關鍵酶[7]，先前的研究表明，乙烯對氣孔運動具有雙重作用。一方面，乙烯可以誘導植物氣孔關閉，而且其信號途徑與ABA誘導氣孔關閉有交叉，共享許多信號組分，比如NO、H2O2、Ca2+和H2S等。乙烯誘導的氣孔關閉過程中，ROS的來源包括NADPH氧化酶和細胞壁過氧化物酶[8]。另一方面，0.3%(V/V)乙烯利又可促進氣孔張開[9]。乙烯可以通過和ABA互作調節氣孔開度，筆者研究中SHAM和CoCl2分別作為細胞壁過氧化物酶抑制劑和ACC氧化酶抑制劑，均可不同程度逆轉白僵菌誘導的氣孔關閉，證明白僵菌可能通過刺激植物生成乙烯和ABA，從而產生一系列下游信號分子，最終導致氣孔關閉。

4 結論

甘草可以誘導甘草表皮氣孔關閉，促使 ROS爆發，Ca2+作為第二信使參與其信號傳遞過程，其信號轉導途徑可能與ABA和乙烯協同互作。