一起蛋雞雞白痢病例的病原分離與鑒定

吳旭錦，朱小甫，楊 萍，高 睿，張文娟，熊忙利，邢 蕾

(1.咸陽職業技術學院 畜牧獸醫研究所，動物疫病分子生物學診斷實驗室，陜西 咸陽 712000；2.咸陽市動物疫病預防控制中心，陜西 咸陽 712000；3.楊凌職業技術學院，陜西 楊凌 712100)

雞白痢(pullorum disease)是雞群常見的一種重要細菌性傳染病，感染范圍廣，經濟損失大，一直是種雞凈化的重點傳染病。其病原為雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)，該菌為腸桿菌科、沙門氏菌屬成員[1]。臨床上雞白痢沙門氏菌主要侵害2～3周齡雛雞，引起雞群腹瀉，拉白色石灰水樣稀糞，或引起敗血癥，死亡率較高。成年雞主要表現為隱性感染，導致產蛋率和受精率下降，雞苗質量不高，經濟損失較大[2,3]。該病既能水平傳播又能垂直傳播，是沙門氏菌病防控的難點之一。抗生素在沙門氏菌病的防控中起了重要作用，但長期以來由于養殖過程中普遍存在濫用、長時間用抗生素現象，導致耐藥性沙門氏菌越來越多，抗生素治療效果不佳，給臨床治療帶來了很大的困擾[4～6]。筆者從渭南市某育成雞場發病雞樣本中分離和鑒定了一株耐藥性雞白痢沙門氏菌，為該病的進一步防治提供了思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2018年12月，陜西渭南某2萬規模的育成雞場，雞群16日齡出現發病情況，發病雛雞精神不振，縮頸閉眼，食欲減退，絨毛蓬松，翅膀下垂，擁擠打堆，病雞排白色漿糊狀糞便，肛門周圍絨毛被糞便污染，病雛叫聲尖銳，發病率約60%，病死率約90%。剖檢死亡雛雞，發現肺臟充血出血，心肌有少量白色結節，肝臟有灰白色壞死灶，膽囊充盈，盲腸腫脹，漿膜有白色結節，腎臟輸尿管充滿尿酸鹽呈花斑樣外觀。雞場先后用慶大霉素、阿莫西林、阿米卡星和復方磺胺氯噠嗪鈉等藥物治療，但沒有任何效果。無菌采集肝臟和脾臟，備用。

1.1.2 試劑 營養肉湯為動物疫病分子生物學診斷實驗室自制；麥康凱瓊脂、SS瓊脂與營養瓊脂為北京奧博星生物技術有限責任公司產品；藥敏紙片與微生物鑒定管，杭州濱河微生物試劑有限公司產品。其他化學試劑均為國產分析純。DNAiso、RNAiso核酸提取試劑、rTaq酶、dNTP等分子生物學試劑，寶生物工程(大連)有限公司產品。

1.1.3 實驗動物 健康小白鼠20只，體重35 g左右，購自空軍軍醫大學實驗動物中心。

1.1.4 引物設計 根據雞白痢沙門氏菌invA基因(EU348368)設計了一對特異性檢測引物，上游引物invA-F序列為ATCATTTCTATGTTCGTCATTC，下游引物invA-R序列為GCGGGAATCCCGGCAGAGTT，預期擴增長度為826bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 用肝臟平整的切面制作觸片，干燥后用革蘭氏染液進行染色，顯微鏡油鏡觀察[7]。無菌法取組織樣品，劃線法接種營養瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和SS平板，37℃有氧條件培養12 h，待形成形態典型的菌落時挑菌接種于普通肉湯，于37℃、200 r·min-1條件下搖動培養12 h。將肉湯培養物再次瓊脂平板劃線，培養后選擇形態特征明顯的菌落，染色鏡檢觀察，視野中為形態單一的細菌時，挑取該菌落菌種接種于肉湯搖動培養，獲得的肉湯即為細菌純培養物。

1.2.2 生化試驗 在生物安全柜中將待檢菌純培養物分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖與甘露醇微量發酵管，置于恒溫箱37℃培養，12 h后觀察結果。用接種針蘸取菌液，在硫酸亞鐵培養基中穿刺接種，恒溫箱37℃培養96 h，觀察穿刺線周圍是否變黑[8]。接種待檢菌在葡萄糖蛋白胨水培養基，培養3 d后進行M.R試驗，觀察結果。將待檢菌接種于鄧亨氏蛋白胨水，培養3 d后進行靛基質試驗[9]。

1.2.3 雞沙門氏菌PCR鑒定 根據DNAiso試劑說明提取純化菌DNA。PCR反應體系組成為DNA模板 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，invA-F、invA-R各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.5μL，超純水補足至25.0 μL。PCR條件：95 ℃ 5 min進行預變性，進入循環后94 ℃ 40 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 50s，共進行35個循環，PCR結束后進行電泳觀察。送PCR產物到生工生物工程(上海)有限公司西安測序部進行序列測定，并比對分析序列結果。

1.2.4 動物回歸試驗 取健康小鼠20只，隨機分為2組，試驗組和對照組各10只，試驗組小鼠每只腹腔注射0.2 mL細菌肉湯，對照組小鼠每只腹腔注射0.2 mL生理鹽水，每日觀察發病情況。

1.2.5 分離菌的藥物敏感性試驗 藥敏試驗采用紙片擴散法。在營養瓊脂平板均勻涂布菌液，待菌液吸收無可流動液體時將藥敏紙片均勻貼在瓊脂表面，37℃培12h后觀察結果，測量抑菌環直徑。

1.2.6 常見禽病毒性疾病RT-PCR檢測 根據RNAiso試劑說明書提取組織病料中的總RNA，采用本實驗室所建立的雞群病原RT-PCR檢測方法，對禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊炎病毒進行排查[10,11]。

1.2.7 雞場水質檢測 水樣為雞場送檢的窖藏水，按照中華人民共和國農業行業標準NY5027-2008進行。將水樣作5倍系列稀釋，選用普通營養瓊脂平板培養計數。另外將水樣接種于SS瓊脂平板，37℃培12 h后觀察。

2 結果

2.1 細菌分離與染色結果

用采集的肝臟組織制作觸片，革蘭氏染色鏡檢，鏡下可見密集的革蘭氏陰性小桿菌。在營養瓊脂平板、麥康凱平板和SS平板上均有細菌生長，在營養瓊脂平板和麥康凱平板上均形成直徑1～3 mm左右大小的灰白色半透明樣菌落，在SS平板上形成直徑1～3 mm左右大小的頂端黑色菌落。挑取典型黑色菌落，染色鏡檢可見形態一致的革蘭氏陰性中等大小的桿菌(圖1)。

圖1 細菌分離與染色鏡檢結果

2.2 生化試驗結果

分離菌能發酵葡萄糖、麥芽糖產酸產氣，能發酵鼠李糖、甘露醇和甘露糖產酸，不發酵乳糖和蔗糖，檸檬酸鹽利用、MR、H2S試驗呈陽性，VP、靛基質試驗呈陰性(表1)。試驗結果符合雞白痢沙門氏菌的生化特征。

表1 分離菌生化鑒定結果

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性，“⊕”表示產酸產氣。

2.3 分離菌PCR鑒定與分析

通過設計的雞白痢沙門氏菌保守基因invA 檢測引物進行PCR擴增，電泳發現成功獲得了826bp的目的條帶(圖2)。PCR產物測序后用DNAstar軟件進行比對分析，發現分離菌invA基因序列與參考菌EU348368、NC003197同源性為99%～100%，提示分離菌確為一株雞白痢沙門氏菌。

2.4 動物回歸試驗結果

接種肉湯的試驗組小鼠12 h內全部死亡，剖檢發現死亡小鼠主要表現為腸炎，腸粘膜充血、出血，腸系膜淋巴結潮紅腫大，被膜緊張，肝臟有針尖大灰白色壞死點，而對照組采食飲水正常，表現健康。動物回歸試驗結果提示分離菌致病性強。

圖2 分離菌PCR檢測結果

2.5 藥物敏感性試驗結果

藥物敏感性試驗結果表明，35種抗生素中，僅有米諾環素有抑菌環，且為中度敏感，其他34種抗生素均無抑菌環，結果表明分離到一株耐藥性極強的細菌(表2)。

表2 藥物敏感性試驗結果

注：R為耐藥，I為中敏，S為高敏。

2.6 病毒RT-PCR檢測結果

經過RT-PCR檢測，禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊炎病毒核酸均為陰性，提示雞群發病與這4種病毒感染無關。

2.7 水質檢測結果

在5倍稀釋的水樣中，細菌分布符合標準規范，進行計數。結果表明，送檢水樣細菌總數為1 005個·mL-1。而標準規定畜禽飲用水總菌群成年家畜不超過100個·mL-1，幼齡家畜不超過10個·mL-1。送檢水細菌總數嚴重超標。為確定水中細菌種類，將水樣接種在SS平板上，結果在SS平板上生長出密布的頂端黑色中等大小菌落，染色鏡檢發現細菌為革蘭氏陰性中等大小桿菌，符合沙門氏菌特征。

3 討論

隨著我國蛋雞養殖水平的不斷提高，雞場一般比較重視沙門氏菌的凈化工作，雞白痢在規模雞場很少發生。但在本病例中，通過RT-PCR檢測，排除了危害性大的4種病毒性傳染病，即禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊炎病毒感染。在細菌分離時我們發現，病死仔雞肝臟中存在大量單一革蘭氏陰性桿菌，不存在其他細菌感染現象。細菌分離鑒定發現分離菌符合雞白痢沙門氏菌的生化特征，通過PCR檢測與invA基因測序分析證實分離菌確為雞白痢沙門氏菌，動物回歸試驗表明分離菌致病性很強，確定了雞白痢沙門氏菌是本次發病的病原。

藥敏試驗結果發現，藥敏試劑盒35種抗生素中，僅有米諾環素1種抗生素中度敏感，其他34種均嚴重耐藥，無任何抑菌環，細菌耐藥性極強，十分罕見，這也是雞場多次更換抗生素仍然效果不佳的主要原因，這一結果和國內其他地區分離菌存在相似之處，即沙門氏菌耐藥性日益嚴峻，且以多重耐藥為特點[1～3]。為闡明感染來源，通過對送檢水樣檢測發現，雞群飲用的窖藏水細菌嚴重超標，為標準的10倍左右。分離細菌發現，水中主要存在沙門氏菌污染，提示雞群發病和水質不潔密切相關，雞群飲用水被沙門氏菌嚴重污染是雞群發病的根本原因。明晰病因后，通過嚴格的飲水消毒和使用敏感藥物，雞群死亡得到了控制，隨后建議雞場棄用窖藏水，改用自來水，定期檢測水質和消毒。在養殖過程中嚴格控制抗生素的使用，必須使用時進行藥敏試驗，避免盲目用藥，減少經濟損失的同時避免細菌耐藥性的產生。