商洛枇杷葉科羅索酸含量及純度測(cè)定

張曉文

(商洛學(xué)院, 陜西 商洛 726000)

枇杷葉為薔薇科植物枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb)的葉子。又名巴葉、蘆桔葉。有清肺止咳，和胃利尿，止渴的功效[1]。研究表明枇杷葉中含多種三萜酸類化合物，以齊墩果酸、科羅索酸、山楂酸為主[2,3]。三萜酸類化合物具有抗炎[4,5]、抗癌[6～8]、降血糖[9]、抗病毒[10]等生物活性，尤其是科羅索酸具有較強(qiáng)的降血糖生物活性[11]。枇杷葉分布于陜西、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、四川、貴州、云南等地，但目前還未見(jiàn)商洛本地枇杷葉中科羅索酸的含量研究。筆者旨在探究商洛本地產(chǎn)枇杷葉中科羅索酸的含量及提取分離方法，為其進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

SHB-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、恒溫水浴鍋、EKY0016058低速臺(tái)式大容量離心機(jī)、GZX-DH-50電熱恒溫干燥箱、UV-2600紫外分光光度計(jì)、日本島津LC-2010 A HT液相色譜儀。

1.2 試劑

甲醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯均為分析純，工業(yè)乙醇，薄層層析硅膠G(青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司)、D101大孔吸附樹(shù)脂(青島海洋化工廠)、C-18反相硅膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、LH-20葡聚糖凝膠(北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司)、科羅索酸標(biāo)準(zhǔn)品(寶雞晨光生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 枇杷葉科羅索酸的提取

枇杷葉于5月份采自商洛市，經(jīng)商洛學(xué)院李筱玲藥師鑒定為薔薇科植物枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb)的葉。洗凈烘干后粉碎，稱取1 kg枇杷葉粗粉置于提取罐中，加入80%乙醇，料液比為1∶8，100℃回流提取2 h，提取液過(guò)濾藥液收集，殘?jiān)糜谔崛」拗校尤?0%乙醇二次回流提取，料液比1∶6，100℃回流提取2 h，提取液過(guò)濾，殘?jiān)鼦壢ニ幰号c一次提取藥液合并收集，合并后藥液減壓濃縮至浸膏，冷凍于-20℃冰箱備用。

2.2 大孔吸附樹(shù)脂初步分離科羅索酸

2.2.1 薄層色譜條件選擇 取科羅索酸標(biāo)準(zhǔn)品少許用甲醇溶解，硅膠G鋪板，0.5 mm毛細(xì)管點(diǎn)板，展開(kāi)系統(tǒng)選擇氯仿-甲醇系統(tǒng)和乙酸乙酯-甲醇系統(tǒng)，按不同比例依次展開(kāi)，顯色劑為重鉻酸鉀-硫酸，5 g重鉻酸鉀溶于100 mL，經(jīng)顯色劑顯色后最終選擇氯仿-甲醇(13∶1)，乙酸乙酯-甲醇(35∶1)。

2.2.2 大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理及分離操作步驟 取部分枇杷葉提取物浸膏60 ℃水浴解凍，解凍后溶解于60%乙醇中，充分溶解后使用離心機(jī)離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為5 000 r·min-1時(shí)間15 min，沉淀收集放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫锨逡河肈101-大孔吸附樹(shù)脂大孔吸附樹(shù)脂分離。上樣完畢后開(kāi)始使用60%乙醇洗脫，前500 mL液體棄去，然后開(kāi)始收集液體(每瓶500 mL)。再分別用70%，80%，90%乙醇溶解沉淀上樣并用相應(yīng)濃度乙醇洗脫。洗脫液按順序編號(hào)、點(diǎn)樣、薄層展開(kāi)、噴顯色劑顯色，將Rf值相同的斑點(diǎn)洗脫液合并。各組分分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小體積，4 ℃保存。

2.2.3 C-18反相硅膠柱純化科羅索酸粗品 用水-甲醇梯度沖洗，依次用10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，85%，100%甲醇洗脫。將收集到的液體點(diǎn)板，相同的合并。

2.2.4 DEAE-Sephadex LH-20柱進(jìn)一步純化 將硅膠柱純化所得產(chǎn)品溶于70%甲醇(3.5 mL)上DEAE-Sephadex LH-20柱進(jìn)一步純化。用70%甲醇洗脫，流速1.0 mL·min-1。按順序編號(hào)點(diǎn)板、薄層展開(kāi)，Rf值相同的斑點(diǎn)洗脫液合并，收集至瓶皿充氮?dú)馐蛊涓稍铩?/p>

2.2.5 產(chǎn)品紫外全波長(zhǎng)掃描 對(duì)純化所得產(chǎn)品進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描定性分析，得到其最大吸收波長(zhǎng)。取少量純化產(chǎn)品使用100%甲醇溶解至3 mL，100%甲醇作為空白對(duì)照，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，波長(zhǎng)范圍為200～700 nm，掃描速度為120 nm·min-1。

2.2.6 高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定純化后產(chǎn)品中科羅索酸純度

(1)色譜條件。色譜柱為BDS HYPERSIL C18色譜柱(Φ4.6×250 mm)；柱溫25℃；流動(dòng)相：甲醇-水(體積比：83∶17)；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。

(2)樣品溶液配制。取純化所得產(chǎn)品使用100%甲醇(色譜純)溶解至1 mL，使用0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾溶液。

3 結(jié)果與分析

3.1 大孔吸附樹(shù)脂分離后科羅索酸粗品產(chǎn)量

對(duì)比不同濃度乙醇薄層色譜結(jié)果，70%乙醇洗脫分離效果較好雜質(zhì)較少，將70%乙醇洗脫液減壓濃縮干燥得到4.69 g科羅索酸。計(jì)算可得科羅索酸含量為0.469%。

3.2 C-18反相硅膠柱純化粗品后產(chǎn)率

純化前稱取粗品0.2226 g，純化后所得產(chǎn)品質(zhì)量為0.0253 g。

3.3 DEAE-Sephadex LH-20柱進(jìn)一步純化

DEAE-Sephadex LH-20柱進(jìn)一步純化后得到產(chǎn)品質(zhì)量為0.0027 g。

3.4 純化產(chǎn)品紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果

經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示純化產(chǎn)品最大吸收波長(zhǎng)為209 nm，紫外全波長(zhǎng)掃描圖如圖1所示：

圖1 純化產(chǎn)品紫外全波長(zhǎng)掃描

3.5 HPLC法測(cè)得產(chǎn)品純度

純化后產(chǎn)品HPLC圖如圖2所示：

圖中標(biāo)記1號(hào)峰為目標(biāo)峰即純化所得科羅索酸，峰面積占峰總面積的49.34%，即科羅索酸純度為49.34%。

圖2 純化產(chǎn)品HPLC圖

4 討論

依據(jù)科羅索酸不溶于水，可溶于熱乙醇、甲醇的特點(diǎn)，筆者研究使用乙醇回流提取枇杷葉中科羅索酸的方法[12,13]。采用大孔吸附樹(shù)脂分離枇杷葉中三萜酸類化合物科羅索酸，薄層色譜結(jié)果表明70%乙醇作為洗脫劑時(shí)分離效果較好，所得粗品中科羅索酸所占比例較大，雜質(zhì)比例較小。科羅索酸粗品經(jīng)C-18反相硅膠和DEAE-Sephadex LH-20柱進(jìn)一步純化后，薄層色譜結(jié)果顯示雜質(zhì)明顯減少。

與呂寒等人研究結(jié)果相比，商洛本地產(chǎn)枇杷葉中科羅索酸含量為0.469%，低于安徽滁州、江西武寧、福建福州、廣東白云山，但高于浙江千島湖、塘棲和蕭山等地[14]。

該制備方法簡(jiǎn)單易行，具有推廣性，進(jìn)一步改良條件后可用于制備液相。若需要高純度的科羅索酸，該方法尚需進(jìn)一步改良。