CD81聯合CD10及CD34在流式細胞術監測兒童B-ALL微小殘留病變中的應用價值

方宗宇，馬莉，周駿，張宇，吳青青

(1貴州醫科大學微生物與免疫學教研室，貴陽 550004;2貴州醫科大學附屬醫院)

研究表明，骨髓中的微小殘留病變(MRD)是兒童和成人急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)臨床診斷結果的有力預測因子[1～3]。在誘導或鞏固治療結束時，MRD>0.01%提示短期或長期復發風險增高[4,5]。流式細胞術(FCM)是臨床最常用的檢測MRD方法[6,7]。CD81是一種具有多種生物學活性的四次跨膜蛋白分子，與CD19形成CD19-CD21-CD81多分子復合物，參與B細胞的信號轉導，對B細胞的發育和體液反應至關重要[8,9]。有研究[10]報道，在一系列急性前體B細胞白血病(pre-B-ALL)病例中，CD81表達異常減弱。其他研究[11]亦發現，CD81在B-ALL MRD陽性病例中異常表達。提示CD81在區分B-ALL細胞和正常B細胞中可能有重要作用。而CD81聯合CD10和CD34在兒童B-ALL MRD檢測中的應用鮮見報道。2017年8月～2018年4月，我們采用FCM檢測一系列患有B-ALL MRD的兒童，探討CD81聯合CD10和CD34在兒童B-ALL MRD監測中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取貴州醫科大學附屬第一醫院兒童血液科2017年8月～2018年4月送檢的27例B-ALL MRD陽性患兒骨髓標本。標本來源患者男12例、女15例，年齡1～15歲，中位年齡4歲。B-ALL診斷基于細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學(MICM)診斷模式，患兒均接受中國兒童白血病組(CCLG)-ALL-2008方案治療[12]。另取同時期10例患有血液系統疾病但已完全緩解患兒的骨髓標本(均含有正常增生的各階段B系細胞)作為對照，其中男5例、女5例，年齡2～13歲，中位年齡6.5歲。本研究經貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，并獲得每位患兒法定監護人的知情同意。

1.2 MRD篩查 使用兩個抗體組合對MRD進行篩查，第一管抗體組合為CD34-FITC/CD10-PE/CD45-Percp/CD19-APC/CD20-PE-Cy7/CD38-APC-Cy7，第二管抗體組合為CD81-FITC /CD10-PE/CD45-Percp /CD34-APC/CD19-PE-Cy。除CD38購自美國Biolegend公司外，其他抗體均購自美國BD公司。27例B-ALL MRD陽性患兒標本中第一管均表現出異常表達，在此基礎上用第二個抗體組合對CD81聯合CD10和CD34進行分析。異常細胞群中細胞抗原表達>20%，且二維點圖中集中出現超過10個異常細胞，定義MRD陽性[13]。

1.3 樣品處理和細胞染色 取EDTA抗凝的骨髓標本(包括對照)制備單細胞懸液，每管樣品細胞數約為1×106；加入單克隆抗體進行標記，置于室溫下避光孵育15 min；加入FACS溶血素(BD，美國)約3.0 mL，再次室溫下避光孵育15 min以溶解紅細胞。用PBS洗滌細胞2次，離心棄上清。最后，加入PBS 500 μL 混勻，使用美國BD公司的FACSCantoⅡ流式細胞儀對細胞進行上樣檢測，至少獲取3×105個活細胞。并通過FACSDiva軟件分析細胞群的抗原表達。為使結果具有可比性，在所有標本中使用相同熒光染料綴合的單克隆抗體。電壓和補償按照儀器使用說明每周調節1次。

1.4 CD81、CD10及CD34在正常B系前體細胞和成熟B細胞中的表達檢測 采用流式細胞儀檢測對照骨髓樣品中的CD19陽性B淋巴細胞。首先基于前向角散射高度(FSC-H)與前向角散射面積(FSC-A)設門(P1)以去除粘連的細胞；然后通過FSC-A和側向角散射面積(SSC-A)(P2)除去死細胞和細胞碎片；最后，通過低至中等SSC并且CD19+(P3)圈出B系細胞。利用CD10和CD34在各期正常B細胞中表達不同，建立CD81/CD10和CD81/CD34的正常表達模式圖。P3中B細胞通過CD34/CD10可分為三個發育階段：早期前體B細胞(P4門)，前體B細胞(P5門)，成熟B細胞(P6門)。

1.5 CD81、CD10及CD34在兒童B-ALL細胞中的表達檢測 基于CD81/CD10和CD81/CD34的正常表達模式圖，如Lucio等[14]描述的一樣，我們定義落在正常骨髓B細胞區域之外的細胞為異常腫瘤細胞，進而觀察CD81聯合CD10和CD34在兒童B-ALL殘留細胞中的異常表達模式。

1.6 B-ALL MRD陽性患兒中CD81檢出率測算 我們以第一個抗體組合(CD34 /CD10 /CD45 /CD19 /CD20 /CD38)檢出異常為標準選擇出27例MRD陽性患兒，其骨髓標本再用流式細胞術檢測第二個抗體組合CD81 /CD10 /CD45 /CD34/CD19 的表達情況，其中檢出率為第二個抗體組合中的出現異常表達模式的病例占第一個抗體組合(共27例)的比例。

2 結果

2.1 CD81、CD10及CD34在正常B系前體細胞和成熟B細胞中的表達 見圖1。在B細胞發育過程中，早期前體B細胞表達 CD10+/CD34+/CD81+(P4門)；前體B細胞表達CD10+/CD34-/CD81+(P5門)；而成熟B細胞表達CD10-/CD34-/CD81dim(P6門)。正常未成熟的B祖細胞顯示出明亮的CD81表達。結果與Muzzafar等[15]描述一致。正常前體B細胞在CD10/CD81和CD34/CD81雙參數點圖上形成緊密重疊的細胞群落，易與白血病細胞區分開。

2.2 CD81、CD10及CD34在兒童B-ALL細胞中的表達 CD81、CD10及CD34異常表達模式見圖2，CD34/CD81雙參數點圖中只有一種異常的表達模式CD34+/CD81dim(圖2B，P4門)；CD10/CD81點圖中可出現兩種異常的表達模式，CD10+/CD81dim和CD10-/CD81+(圖2C和D，P4門)。在B-ALL MRD陽性標本中，CD19+/CD34+或CD19+/CD10+白血病細胞顯示CD81表達減低(圖2A-C，P4和P5門)的比例分別占55.6%(15/27)和37.1%(10/27)，另外在3例MRD陽性病例中，CD81陽性細胞顯示CD10丟失(圖2D，P4門)，而CD81聯合CD10及CD34能檢測出高達81.5%(22/27)的陽性病例。觀察組有2例在誘導化療后15 d和33 d連續檢測到MRD陽性，他們在化療15 d時表達的異常模式為CD34+/CD81dim，在33 d時2例殘留白血病細胞持續表達CD34+/CD81dim(圖3)。

注：早期前體B細胞和前體B細胞的CD81均顯示出明亮表達，而成熟B細胞則弱表達CD81(即CD8dim)。

圖1 設門策略及正常B細胞發育過程中CD81表達模式

3 討論

FCM利用白血病細胞表面抗原，即白血病相關免疫表型(LAIP)識別異常細胞[14,16]。應用FCM對B-ALL進行MRD評估，能準確、敏感地將白血病細胞從再生淋巴細胞中分離出來[17]。用FCM檢測MRD會受化療或骨髓移植治療后骨髓中增生的正常前體細胞影響，因此兒童B-ALL的MRD監測依賴于白血病細胞和正常發育B祖細胞中抗原的差異表達。Barrena等[18]首先描述了正常B細胞 成熟過程中的CD81表達，并檢測了多種B系腫瘤中的CD81表達情況，他們在早期CD34+/ CD10+和晚期CD34-/CD10+B系前體細胞中均一地高表達CD81。CD81在其研究中的12例pre-B-ALL病例中有9例(75%)異常表達降低。本研究再次印證了上述結果，CD10+或CD34+的殘留白血病細胞中CD81異常弱表達比例占70.4%(19/27)。

注：A殘留白血病細胞異常表達CD10+/CD81dim和CD34+/CD81dim；B殘留白血病細胞僅異常表達CD34+/CD81dim；C殘留白血病細胞僅異常表達CD10+/CD81dim；D殘留白血病細胞僅異常表達CD10-/CD81+。

圖2 CD81/CD10、CD81/CD34在B-ALL MRD中異常表達模式

注：A和C分別為兩個患者誘導化療后15 d時異常表達CD34+/CD81dim，B和D為相應患者在誘導化療后33 d時的CD34+/CD81dim異常表達，百分數為異常白血病細胞占有核細胞的百分比。

圖3 2例患兒誘導化療后15 d和33 d時的CD81表達

Tsitsikov等[10]發現，使用CD45、CD19、CD34、CD10、CD20、CD38、CD58和CD81的組合，在86例B-ALL MRD陽性病例中可檢測到85例異常，正常B細胞在CD38/CD81和CD58/CD81點圖上形成緊密的細胞群，從而使多數異常B淋巴白血病細胞與正常B細胞較好地分離。Muzzafar等[15]認為，CD81特別適用于pre-B-ALL中MRD的流式細胞術檢測，因為在多數情況下，白血病細胞會落在B細胞CD81表達的正常范圍外，在缺乏正常骨髓細胞的區域中形成群落。因此盡管存在大量正常B細胞群，少量的白血病細胞亦可被識別。本實驗中我們發現，正常B系細胞在CD10/CD81聯合CD34/CD81兩個雙參數點圖亦形成緊密的群落，使異常的B淋巴細胞易于區分。

本研究結果顯示，CD10/CD81單獨使用時對兒童B-ALL MRD的檢出率為48.2%(13/27)，但對于CD81異常弱表達，而CD10丟失的腫瘤細胞可能會漏檢；CD34/CD81單獨使用檢出率為55.6%(15/27)，而對于CD81異常弱表達，而CD34丟失的腫瘤細胞亦可能會漏檢；這可能是由于B淋巴白血病細胞的異質性導致較早期的細胞可能丟失CD10或CD34，從而異常減弱的B腫瘤細胞與正常成熟B淋巴細胞在CD81/CD10或CD81/CD34二維點圖上重疊，無法區分出腫瘤細胞。而CD81聯合CD34和CD10可在高達81.5%(22/27)的MRD陽性病例中顯示異常表達。可見，CD81與CD10及CD34聯用可提高兒童B-ALL MRD的檢出率。

在白血病細胞上特異表達，且在化療后殘留腫瘤細胞上穩定表達的標志物是用于監測MRD的良好指標。本研究中有2例患兒在化療后15和33 d時MRD持續陽性，其白血病細胞持續表達CD34+/CD81dim，其中1例還持續異常表達CD10+/CD81dim。Muzzafar等[15]發現，91%的病例中，CD81在化療后1個或更多個后續時間點持續保持異常弱表達。可見CD81異常弱表達在B-ALL的MRD監測中較穩定可靠。

綜上所述，CD81聯合CD10、CD34用于監測兒童B-ALL MRD有較高的陽性率，且在2例MRD持續陽性的患兒中，于不同時間點呈現相同模式的弱表達，提示CD81在兒童B-ALL MRD監測中是一個敏感、穩定且特異的指標。