宮頸癌患者血清微小RNA-196a表達變化及意義

李小燕，謝永紅，楊麗

(廣州軍區廣州總醫院一五七分院，廣州 510510)

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，其發病率僅次于乳腺癌。據統計，全球每年約有53萬宮頸癌新發病例[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是誘發宮頸癌的首要危險因素。此外，吸煙、多孕多產等亦是導致宮頸癌發生的重要危險因素[2]。手術、放療和化療是宮頸癌的一線治療方案。目前臨床仍缺乏特異度、靈敏度較高的宮頸癌靶標。微小RNA(miRNAs)是由21～25核苷酸組成的非編碼RNA，可在轉錄后調節基因表達。目前已證實，miRNAs在細胞的各種生理過程中均發揮作用，且miRNAs異常表達可導致疾病發生，包括惡性腫瘤[3]。根據miRNAs靶基因的功能，miRNAs可同時兼具促癌基因和抑癌基因功能。miR-196a被證實可促進胃癌[4]、肝癌[5]和子宮內膜癌[6]等惡性腫瘤形成，同時胰腺癌患者血清miR-196a表達增加，且血清miR-196a表達與臨床分期和生存時間相關[7]。Liu等[8]發現，宮頸癌組織中miR-196a表達增加，而宮頸癌患者血清中miR-196a表達表達是否增加目前尚不清楚。

2014年1～12月，我們檢測了宮頸癌患者血清miR-196a表達，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年1～12月入住我院的宮頸癌患者80例，納入標準：①具備完整病歷資料；②病理診斷證實為宮頸癌；③術前未接受放化療等抗腫瘤治療。排除標準：①合并其他婦科疾病；②合并其他惡性腫瘤；③合并肝腎等重要器官功能不全；④年齡>70歲；⑤失訪病例。80例宮頸癌患者年齡25～70(50.12±6.32)歲，其中≤50歲者46例，>50歲者34例。腫瘤直徑：≤4 cm者51例，>4 cm者29例。病理分級：G1級28例，G2級24例，G3級28例。淋巴結轉移：無淋巴結轉移者49例，有淋巴結轉移者31例。HPV感染：無HPV感染4例，有HPV感染76例。國際婦產科聯盟(FIGO)分期：Ⅰ期56例，Ⅱ期24例。以確診時間為起點，以門診、電子通訊的方式，對宮頸癌患者進行隨訪調查，直至患者死亡或隨訪時間結束(2018年9月)。同期選取于我院體檢的80例女性健康志愿者作為對照，年齡24～68(50.64±7.04)歲。宮頸癌患者與健康對照者年齡比較無統計學差異(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得我院倫理委員會審核批準。研究對象均簽署知情同意書。

1.2 血清miR-196a表達檢測 抽取所有研究對象(宮頸癌患者術前，健康志愿者體檢時)晨起空腹外周靜脈血5 mL，4 ℃、2 000 r/min離心5 min，收集上層血清，置于-80 ℃冰箱保存備用。嚴格參照血清miRNA提取試劑盒miRVanTMPARISTMkit(美國Ambion公司)說明書操作，加入 TRIzol試劑1 mL，室溫靜置5 min裂解細胞。加入氯仿，劇烈搖晃10 s后，室溫靜置5 min；15 000 r/min，4 ℃低溫離心15 min，取上清，與等體積異丙醇混勻，室溫靜置10 min； 4 ℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清，加乙醇洗滌， 4 ℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清，即可得RNA沉淀；加入適量DEPC水溶解，采用微量紫外分光光度計(NanoDrop2000，美國Thermo公司)檢測RNA濃度和純度[光密度(OD)260/OD280值為1.8～2.0)]。采用TaqMan?miRNA reverse transcription kit(美國ABI公司)進行反轉錄，嚴格參照試劑盒說明進行操作，產物cDNA置于-20 ℃冰箱保存備用。采用TaqMan microRNA檢測試劑盒(美國ABI公司)檢測血清miR-196a表達，反應體系為10 μL。反應條件：94 ℃預熱10 min，95 ℃15 s、60 ℃1 min，共40個循環。miR-196a正向引物：5′-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3′，反向引物：5′-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6為內參，2-ΔΔCT法計算miR-196a的相對表達量，其中CT=宮頸癌患者(CTmiR-196a-CTU6)-健康志愿者(CTmiR-196a-CTU6)，每個樣本進行3次獨立重復實驗后，對所得數據進行統計分析。以上指標檢測由第三方檢測機構廣東金域醫學檢驗中心操作。

2 結果

2.1 宮頸癌患者與健康志愿者血清miR-196a表達比較 宮頸癌患者、健康志愿者血清miR-196a相對表達量分別為3.17±1.63、0.95±0.21，兩者比較差異有統計學意義(t=12.082，P=0.000)。

2.2 血清miR-196a表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 宮頸癌患者血清miR-196a表達與患者年齡、腫瘤病理分級、HPV感染無關(P均>0.05)；宮頸癌患者血清miR-196a表達與患者腫瘤直徑、有無淋巴結轉移和FIGO分期有關(P均<0.05)，即腫瘤直徑>4 cm、有淋巴結轉移、FIGO分期為Ⅱ期的患者血清miR-196a表達高于腫瘤直徑≤4 cm、無淋巴結轉移、FIGO分期為Ⅰ期的患者(P均<0.05)，見表1。

表1 宮頸癌患者血清miR-196a表達與臨床病理特征的關系

2.3 血清miR-196a表達與宮頸癌患者預后的關系 以血清miR-196a相對表達量的平均值為界限，將宮頸癌患者分為miR-196a高表達組(>平均值)42例和miR-196a低表達組(≤平均值)38例。建立生存率分析的Kaplan-Meier乘積極限模型(圖1)。結果顯示，miR-196a高表達組中位生存時間為26.2個月，3年生存率為38.10%(16/42)。miR-196a低表達組中位生存時間為38.3個月，3年生存率為71.05%(27/38)，均優于miR-196a高表達組。經Log-Rank檢驗，兩組3年生存率比較差異有統計學意義(χ2= 5.082，P=0.024)。

圖1 宮頸癌患者Kaplan-Meier生存曲線

2.4 血清miR-196a表達對宮頸癌的診斷價值 將血清miR-196a相對表達量劃分為若干組段，建立ROC曲線分析模型。取約登指數(靈敏度+特異度-1)最大點為最佳臨界值/理論閾值。結果顯示，約登指數最大點為0.597，理論閾值點(血清miR-196a相對表達量)為1.37，對應的靈敏度為0.832，特異度為0.765，ROC曲線下面積(AUC)為0.853，見圖2。

圖2 血清miR-196a診斷宮頸癌的ROC曲線

3 討論

miRNAs表達異常與腫瘤形成和惡性進展密切相關。因此，與腫瘤臨床病理特征和患者預后相關的miRNAs分子具有作為腫瘤靶標的價值。目前，miR-196家族共發現miR-196a-1、miR-196a-2和miR-196b三個成員，其中miR-196a基因定位于HOX基因簇中[9，10]，miR-196a異常表達在腫瘤形成中發揮重要作用。miR-196a參與了腫瘤發生、細胞分化、免疫應答、炎癥反應和病毒防御等多個重要生理過程[6，11]。研究[12]發現，聯合檢測血清miR-196a和miR-196b有助于舌癌的早期診斷。Zhang等[13]發現，骨肉瘤患者的血清miR-196a和miR-196b表達升高，且可作為預測患者不良預后的靶標。此外，血清miR-196a和miR-196b可作為侵襲性胃癌的新靶標。本研究之前，我們以miRNA芯片雜交檢測法篩選了體外宮頸癌細胞系的miRNA表達譜，發現miR-196a存在高度表達異常，因此推測miR-196a對于宮頸癌可能存在診斷價值。

本研究結果顯示，宮頸癌患者血清miR-196a表達高于健康志愿者,差異有統計學意義。多項研究證實，miR-196a在宮頸癌組織、宮頸癌細胞中均表達增加[8, 14]。由此推測，miR-196a可能參與并促進了宮頸上皮癌變過程，具有促癌基因功能。本研究發現，腫瘤直徑>4 cm患者的血清miR-196a表達高于腫瘤直徑≤4 cm患者，提示miR-196a可促進宮頸癌細胞增殖。Hou等[15]發現，miR-196a可通過調節FOXO1和p27Kip1基因表達，促進宮頸癌細胞增殖；Zhang等[16]在宮頸癌細胞中增加miR-196a表達可促進細胞增殖，并通過降低NTN4基因表達實現。一個miRNAs分子可靶向多個基因表達進而發揮生物學活性，后續研究中我們將尋找miR-196a可能靶向的其他與腫瘤增殖相關的基因，進一步闡述miR-196a調控宮頸癌細胞增殖的具體機制。此外，本研究發現，有淋巴結轉移者血清miR-196a表達較高，提示miR-196a可能促進了宮頸癌細胞的淋巴結轉移。Tsai等[17]在胃癌細胞中的研究發現，miR-196a可下調Radixin基因表達進而促進細胞侵襲，且在食管鱗狀細胞癌中，miR-196a可通過調節RAP1A基因表達促進細胞侵襲[18]。參與調控腫瘤細胞侵襲遷移的基因甚多，后續我們將在體外細胞水平繼續尋找miR-196a靶基因，尤其是與腫瘤侵襲遷移相關的靶基因。本研究結果顯示，FIGO分期較高的宮頸癌患者血清miR-196a表達較高，提示監測宮頸癌患者血清miR-196a表達有助于評估患者病情進展，從而根據患者病情進展及早給予相應治療，以有效提高患者生存率并改善患者的預后。本研究發現，血清miR-196a表達較高患者的3年總生存率較低、中位生存時間較短，患者預后較差.由此推測，宮頸癌患者血清miR-196a表達是宮頸癌患者預后的負性調控因子，與患者不良預后關系緊密，監測宮頸癌患者血清miR-196a表達有助于對患者預后進行初步判斷。而Yang等[19]發現，當miR-196a表達受抑制時，宮頸癌細胞的增殖與侵襲均受到抑制，提示監控miR-196a表達可用于評估宮頸癌的惡性程度，有助于臨床及時調整治療方案，從而改善患者預后。血液檢查具有方便、簡單等特性，在腫瘤診斷方面具有較高的應用前景。本研究采用ROC曲線檢驗血清miR-196a表達對宮頸癌患者診斷的價值，結果顯示，血清miR-196a表達對宮頸癌診斷的靈敏度為0.832，特異度為 0.765，AUC為0.832，AUC>0.7則反映預測的準確性較高，由此推測，血清miR-196a是診斷宮頸癌的較好指標。

綜上所述，宮頸癌患者的血清miR-196a表達增高，且與腫瘤直徑、淋巴結轉移、FIGO分期、3年生存率相關;監測血清miR-196a表達有助于對患者病情進展和預后進行評估，同時血清miR-196a表達對宮頸癌診斷有較高價值。