低溫大氣壓等離子體激活培養(yǎng)基選擇性殺傷三陰性乳腺癌細(xì)胞

項(xiàng)良劍, 徐瀟宇, 張 碩, 蔡東焱, 戴曉峰

(1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122；3. 江南大學(xué) 物聯(lián)網(wǎng)工程學(xué)院, 無錫 214122; 4. 江南大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科， 無錫 214062)

CAP是物質(zhì)的第4種狀態(tài)，近年來，因其具有抗菌和消炎作用而被廣泛應(yīng)用于潰瘍治療和傷口愈合上[1-2]。CAP在2007年被首次報(bào)道對黑色素瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用[3]，引起了人們對研究CAP治療腫瘤方面的興趣。CAP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是劑量依賴型的[4-5]，大量的體外[6-8]和小鼠體內(nèi)[9-11]研究已經(jīng)還證明一定強(qiáng)度的CAP能夠選擇性殺死癌細(xì)胞，而對正常細(xì)胞沒有影響。Metelmann等人進(jìn)行了一次應(yīng)用CAP治療12位患有晚期頭頸部腫瘤患者的臨床研究，結(jié)果顯示CAP可以緩解患者疼痛而且沒有明顯的副作用[12]。CAP除了本身作為一種癌癥治療的手段之外，與現(xiàn)有的抗腫瘤藥物如替莫唑胺[4]、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體[13]和納米顆粒[14]具有良好的協(xié)同作用。

乳腺癌在女性腫瘤患者中發(fā)病率高居榜首，死亡率位居第二[15]。乳腺癌臨床治療的難點(diǎn)在于它的高度異質(zhì)性，不同亞型的乳腺癌患者的臨床表現(xiàn)、惡性程度及預(yù)后情況都千差萬別，因此也帶來了多種多樣的治療方式。根據(jù)免疫組化法和/或基因表達(dá)譜，乳腺癌至少可以分類為luminal型、HER2陽性和三陰性[16]，其中三陰性乳腺癌缺乏有效的靶向治療，預(yù)后較差，使得我們需要找到副作用小的，靶向于三陰性乳腺癌的治療方法[17-18]。

受到CAP選擇性殺死癌細(xì)胞這個(gè)特性的啟發(fā)，本研究想要探究CAP對不同亞型乳腺癌細(xì)胞系的影響。本研究以正常乳腺細(xì)胞系MCF10A為對照細(xì)胞，使用涵蓋兩個(gè)乳腺癌亞型的3種乳腺癌細(xì)胞系來評估CAP對不同亞型乳腺癌細(xì)胞的活性和遷移能力的影響。本研究提出了CAP殺傷作用與乳腺癌亞型之間的相關(guān)性，而且有利于推進(jìn)CAP在腫瘤治療上的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

人源正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A和人源Luminal A亞型乳腺癌細(xì)胞系MCF7由江南大學(xué)關(guān)鋒教授贈(zèng)予，人源三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDAMB231由江南大學(xué)尹健教授贈(zèng)予，人源三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDAMB468由昆士蘭科技大學(xué)Rik Thompson教授贈(zèng)予。

1.1.2 主要試劑和儀器

DMEM和DMEM/F-12培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自Lonsera公司，PBS和胰酶購自杭州吉諾公司，雙抗購自Thermo Fisher公司。CCK-8試劑購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司，凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。RIPA裂解液(P0013B)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009)購自碧云天公司。一抗：GAPDH兔多抗(10494-1-AP)、ERK兔多抗(16443-1-AP)、JNK兔多抗(51151-1-AP)和p38兔多抗(14064-1-AP)購自Proteintech公司，p-ERK兔多抗(4370)、p-JNK兔多抗(4668)和p-p38兔多抗(4511)購自Cell Signaling Technology公司。二抗：HRP標(biāo)記的二抗購自Proteintech公司。High-sig ECL Western Blotting Substrate 購自Tanon公司。

高純氦氣(He)購自無錫新南化學(xué)氣體有限公司，CAP電源(CTP-2000K)購自南京蘇曼電子有限公司，氦氣轉(zhuǎn)子流量計(jì)購自科隆(上海)測量儀器有限公司，酶標(biāo)儀(EZ Read 800)購自英國柏楉有限公司，流式細(xì)胞儀FACSCalibur 購自美國BD公司，化學(xué)發(fā)光圖像分析儀購自Tanon公司。

1.2 方法

1.2.1 處理?xiàng)l件與處理方式

CAP射流裝置如圖1所示，處理?xiàng)l件為放電電壓1～1.4 kV，頻率8.8 kHz，高純氦氣流量1 L/min，培養(yǎng)基液面與CAP管口距離1.3 cm。

CAP處理方式主要分為CAP直接處理與PAM間接處理。CAP直接處理是將裝有細(xì)胞和培養(yǎng)基的多孔板直接放置在CAP射流下方處理一定時(shí)間(圖2-A)；而PAM間接處理則是將裝有培養(yǎng)基的多孔板放置在CAP射流下方處理一定時(shí)間，處理后的培養(yǎng)基即為PAM，使用PAM來培養(yǎng)細(xì)胞(圖2-B)。

圖1 CAP裝置圖

A: CAP treatment; B: PAM treatment

圖2 CAP處理方式示意圖以及不同處理方式對MDAMB468細(xì)胞活性影響的結(jié)果比較
Figure 2 Schematic representation of the CAP treatment and results of CAP and PAM treatment on MDAMB468

1.2.2 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

使用培養(yǎng)基制備1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按照每孔100 μL接種到96孔板內(nèi)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，按照CAP直接處理的方式對96孔板內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行處理，處理時(shí)間分別為20、30、40和50 s；或者按照PAM間接處理的方式，按2 mL/孔將培養(yǎng)基加入到12孔板中，使用CAP處理，按時(shí)間梯度2、3、4、5 min，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理一孔培養(yǎng)基，處理完畢得到PAM后，按照100 μL PAM/孔替換掉96孔板中的舊培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μL CCK-8試劑，在CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀在450 nm 處測定各孔吸光值A(chǔ)。計(jì)算公式為：

其中Y表示細(xì)胞活性,APAM表示實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞+PAM處理)吸光值，A0表示空白組(僅有培養(yǎng)基)吸光值，ACon表示對照組(細(xì)胞+培養(yǎng)基)吸光值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將胰酶消化后的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按照30萬/孔接種于6孔板中。細(xì)胞貼壁后，將不同孔細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。按照2 mL/孔將培養(yǎng)基加入到12孔板中，使用CAP處理5 min得到PAM，將實(shí)驗(yàn)組中的舊培養(yǎng)基替換為PAM，對照組中的舊培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用無EDTA的胰酶將細(xì)胞消化，制備成單細(xì)胞懸液，移入1.5 mL離心管中，1000 r/min，離心5 min后去上清，用Binding buffer重懸細(xì)胞，制備濃度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每100 μL懸液作為一個(gè)細(xì)胞樣品加入5 μL Annexin-V FITC染液，避光孵育15 min, 再加入5 μL PI染液，避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

將胰酶消化后的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按照100萬/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁且匯合度達(dá)到90%～100%后，加入終濃度為10 μg/mL的絲裂霉素繼續(xù)培養(yǎng)2 h，以抑制細(xì)胞增殖能力。用200 μL無菌槍頭在每孔中均等劃3條直線，用含1% FBS的培養(yǎng)基漂洗3遍，去除細(xì)胞碎片，按照2 mL/孔將含有1%FBS的新鮮培養(yǎng)基加入到12孔板中，使用CAP處理5 min得到PAM，將實(shí)驗(yàn)組中的舊培養(yǎng)基替換為PAM，對照組中的舊培養(yǎng)基替換為含1%FBS的新鮮培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察并拍照0和24 h時(shí)的細(xì)胞圖片，使用Image J測量劃痕面積，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的相對遷移率。計(jì)算公式為：

γ表示相對遷移率,S0PAM表示實(shí)驗(yàn)組0 h劃痕面積,SiPAM表示實(shí)驗(yàn)組0 h劃痕面積，S0Con表示對照組0 h劃痕面積，SiCon表示對照組第ih劃痕面積。

1.2.5 Western Blot檢測

按照“1.2.3”部分的處理方法處理細(xì)胞并孵育8 h后，使用裂解液RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白并定量。取50 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳并利用電轉(zhuǎn)儀將目的蛋白轉(zhuǎn)印至適合大小的PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后用TBST洗膜3次，并使用含5 %脫脂奶粉的TBST封閉2 h，封閉后TBST洗膜3次，根據(jù)產(chǎn)品推薦的稀釋倍數(shù)稀釋一抗，4℃孵育過夜，一抗孵育后用TBST洗膜3次，再使用二抗(1∶4000)室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次，ECL試劑顯色發(fā)光后成像。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，用Origin 8和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用雙邊法t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plasma處理方式的選擇

本研究對MDAMB468細(xì)胞分別進(jìn)行CAP處理和PAM處理，并測定細(xì)胞活性，結(jié)果如圖2所示，CAP直接處理的方式得到的細(xì)胞活性數(shù)值的誤差值比較大，在0.17左右(圖2-A)，而PAM方法得到的誤差值僅在0.03左右(圖2-B)，即PAM能得到穩(wěn)定性更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這可能是CAP直接處理過程中存在不均一性，細(xì)胞受到的外界刺激強(qiáng)度是不同的。而PAM在制備完畢后，活性物質(zhì)在培養(yǎng)基中是均勻分布的，在PAM替換掉孔中的舊培養(yǎng)基后，不同孔中的細(xì)胞受到的外界刺激強(qiáng)度相對一致。因此，本研究選擇PAM的處理方式對細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PAM選擇性抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的活性

本研究對4株細(xì)胞系進(jìn)行PAM處理，檢測細(xì)胞活性，結(jié)果(圖3)顯示，MCF10A的細(xì)胞活性受PAM影響很小，MDAMB468和MDAMB231的細(xì)胞活性隨著培養(yǎng)基處理時(shí)間的延長而降低，最多分別降低到46%和41%，而MCF7的細(xì)胞活性隨著PAM強(qiáng)度的增強(qiáng)而提高，最高提高到1.44倍。這說明PAM能選擇性抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活性。

2.3 PAM選擇性誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡

為了驗(yàn)證PAM抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活性是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)，我們檢測了PAM處理后4株細(xì)胞系的凋亡情況。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果如圖4-A、B所示。在相同PAM處理?xiàng)l件下，MDAMB468和MDAMB231細(xì)胞PAM實(shí)驗(yàn)組的凋亡比例是各自對照組的2.33倍和2.62倍，而MCF10A和MCF7細(xì)胞PAM實(shí)驗(yàn)組的凋亡比例僅僅是各自對照組的1.31倍和1.26倍。這說明PAM能選擇性誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖3 PAM對MCF10A和乳腺癌細(xì)胞活性的影響

2.4 PAM選擇性抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移能力

細(xì)胞遷移是癌細(xì)胞的一項(xiàng)重要惡性指標(biāo)，本研究通過劃痕實(shí)驗(yàn)來檢測PAM對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。如圖5-A和5-B所示，PAM將三陰性乳腺癌細(xì)胞MDAMB468和MDAMB231的遷移能力分別降低到58%和79%。而MCF10A和MCF7的遷移能力受到PAM的影響較小。這說明PAM能選擇性抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。

A: Cells were analyzed by FACS following Annexin V and propidium iodide staining; B: Quantitative evaluation of cell apoptosis assay (*P<0.05)

圖4 PAM對MCF10A和乳腺癌細(xì)胞凋亡比例的影響

Figure 4 Effects of PAM on apoptosis of MCF10A and breast cancer cells

A: Pictures of cell migration; B: Quantitative evaluation of cell migration assay (*P<0.05)

圖5 PAM對MCF10A和乳腺癌細(xì)胞遷移影響

Figure 5 Effects of PAM on cell migration of MCF10A and breast cancer cells

2.5 PAM選擇性抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的JNK磷酸化水平

有研究報(bào)道稱MAPKs在三陰性乳腺癌中相較于非三陰性乳腺癌激活程度更高[19-21]。我們檢測了MCF7和MDAMB231在PAM處理前后ERK、JNK和p38總蛋白表達(dá)量和磷酸化程度的變化。結(jié)果如圖6所示，PAM基本不影響MCF7中 ERK、JNK和p38的總蛋白表達(dá)量以及磷酸化程度；對于MDAMB231，PAM能夠降低JNK的磷酸化水平而對ERK和p38影響很小。

3 討論與結(jié)論

CAP的選擇性抗腫瘤作用已經(jīng)在超過20種癌癥中得到了證實(shí)[22-24]。據(jù)報(bào)道，CAP在體外[22]和體內(nèi)[10]都能選擇性殺死乳腺癌細(xì)胞而對正常細(xì)胞沒有明顯的殺傷作用。雖然很多報(bào)道稱PAM能選擇性殺死乳腺癌細(xì)胞，但是卻很少有學(xué)者針對PAM的選擇性殺傷能力與乳腺癌亞型進(jìn)行研究。有研究報(bào)道中提到當(dāng)用相同劑量的PAM培養(yǎng)時(shí)，MDAMB231的增殖能力顯著低于MCF7[24-25]。在本研究中，我們加入MCF10A為對照細(xì)胞，控制PAM的強(qiáng)度，探究PAM對多個(gè)三陰性乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞活性的影響，同時(shí)還檢測了PAM對不同亞型細(xì)胞系遷移能力的影響。

A: Total and phosphorylation levels of JNK, p38 and ERK in MCF7 and MDAMB231 before and after PAM treatment for 8 h; Relative bands density of p-JNK, p-p38 and p-ERK in MCF7 (B) and MDAMB231(C) before and after PAM treatment for 8 h (*P<0.05)

圖6 PAM處理前以及PAM處理8 h后，MCF7和MDAMB231中JNK、p38和ERK總蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)量
Figure 6 Total and phosphorylation levels of JNK, p38 and ERK in MCF7 and MDAMB231 before and after PAM treatment for 8 h

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定劑量的PAM可以選擇性抑制三陰性細(xì)胞的增殖和遷移能力，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，而對正常細(xì)胞和非三陰性細(xì)胞影響較小。目前關(guān)于PAM抗癌特性的機(jī)制研究得還不是很深入，普遍被認(rèn)可的一種機(jī)制是CAP處理后的PAM中含有大量ROS，如H2O2[26]和OH[27]，PAM通過提高癌細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平以殺死癌細(xì)胞[7]。癌細(xì)胞的胞內(nèi)ROS水平高于正常細(xì)胞[6, 28]，PAM產(chǎn)生大量ROS刺激細(xì)胞，使得胞內(nèi)ROS水平上升，癌細(xì)胞相對于正常細(xì)胞更容易達(dá)到凋亡閾值并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而三陰性細(xì)胞具有比Luminal A型細(xì)胞更高的p53突變率(即三陰性，HER2陽性，Luminal A和Luminal B腫瘤分別為80%、72%、12%和29%)[29-30]。有研究報(bào)道p53的高突變率會(huì)導(dǎo)致更高的胞內(nèi)ROS水平[31]和更多的DNA損傷[32]，而更多的DNA損傷會(huì)導(dǎo)致三陰性細(xì)胞中抗氧化系統(tǒng)更加紊亂[33]。我們推測較高的ROS水平和較弱的抗氧化能力共同使三陰性乳腺癌細(xì)胞更容易被PAM殺死。

另外，相對于MCF7，MAPK/JNK信號途徑在MDAMB231中被高度激活，PAM能夠降低JNK磷酸化程度(圖6)，Chen等報(bào)道ROS可以通過抑制JNK磷酸化來誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[34]，說明PAM選擇性殺死三陰性乳腺癌細(xì)胞可能跟MAPK/JNK信號途徑有關(guān)。

總之，本研究為探索CAP選擇性殺傷三陰性乳腺癌亞型細(xì)胞的機(jī)制提供了前期基礎(chǔ)，我們推測累積的基因組突變和高度激活的MAPK/JNK信號通路使三陰性細(xì)胞對PAM的敏感性比非三陰性細(xì)胞更高。將來的研究工作將從這兩個(gè)方面探索CAP選擇性殺死三陰性乳腺癌細(xì)胞的機(jī)制。