作物STAYGREEN功能與調控的研究進展

陳耀宇, 王曙光, 孫黛珍

(山西農業大學 農學院， 太谷 030801)

植物衰老是一個內在的細胞編程性死亡過程，最明顯的標志是植物器官由綠變黃，原因是葉綠素降解和光合能力的下降[1]。然而，過早地衰老會導致作物品質下降、糧食減產。延緩葉片衰老可在灌漿期維持同化碳向籽粒的供應，從而保證最大糧食產量。

Thomas和Howarth[2]認為持綠是一種植物在花后發育過程中葉片衰老延遲的現象，這種現象可能是由于葉片衰老起始晚或者衰老速率慢引起的。因此，Thomas和Smart[3]依據植物葉片衰老起始的早晚與衰老速率的快慢將持綠突變體分成了5類。A型持綠突變體衰老開始晚，但葉綠素降解速率與野生型相同，延長了光合作用時間。B型持綠突變體衰老開始時間與野生型相同，但葉綠素降解速率較慢，延遲了葉片衰老。C型持綠突變體起始衰老時間和完全衰老時間均與野生型相同但由于葉綠素降解紊亂，葉綠素含量幾乎保持不變。D型持綠突變體由于突然冷凍或干燥導致葉片死亡，但葉綠素得以保留。E型持綠突變體在成熟期的葉綠素含量高于野生型，在植株衰亡后其葉綠素還未完全降解。A型、B型持綠突變體屬于功能型持綠突變體，在葉綠素得以保留的同時，光合作用的時間延長也增加，因此產量提高。C型、D型、E型持綠突變體屬于非功能型持綠突變體，雖然在葉片衰老過程中葉綠素降解緩慢或推遲，但缺乏光合作用的能力[4]。

近年來，利用先進的生物技術手段，已鑒別了一大批持綠突變體，如：STAYGREEN(SGR)[5]、chlorophyll b reductase(CBR)[6]、NON-YELLOW COLORING1 (NYC1)、NYC1-LIKE (NOL)[7]、pheophorbide a oxygenase(PAO)[8]、pheophytin pheophorbide hydrolase (PPH)[9]等，這些突變體都是由于葉綠素降解相關基因的缺失或突變而形成的(表1)，其中SGR1/NYE1突變體的發現對于研究植物葉綠素降解機制具有重要的作用[10]。本文敘述了SGR的功能、SGR與葉綠素代謝、SGR調控的最新研究進展，為解析作物葉綠素降解機制提供參考。

表1 葉綠素代謝相關基因及持綠突變體

1 SGR的功能

孟德爾的綠粒豌豆被廣泛應用于遺傳原理的研究，而控制綠粒豌豆非黃化性狀的單隱性基因多年來也一直被科學家所關注。Armstead和他的同事們將控制孟德爾綠粒豌豆性狀的基因命名為SGR1或NYE1[11]。Wang等[12]以大白菜nye突變體為材料，精細定位了BrNYE基因，Jiang等[5]利用水稻sgr突變體，克隆了OsSGR基因。Sato等[13]通過對豌豆和水稻的sgr突變體的研究發現衰老后期突變體的葉綠素含量較高，因此他們認為SGR能夠促進葉綠素的降解。

系統發生分析表明高等植物的SGR蛋白質可以被劃分為兩類[14]：一類為SGR亞族，包含能引起持綠突變的保守結構域；一類為SGRL亞族，SGRL蛋白的C端序列與SGR蛋白的C端序列有很大不同，但在不同的植物中也具有高度保守的結構。所有的高等植物至少含有一種SGRL蛋白，可能含有兩種或多種SGR蛋白[15]，并都被定位到葉綠體上[14]，這也表明SGR可能在質體中起作用，與葉綠素代謝相關聯。研究發現，隨著草莓果實的成熟，SGR蛋白活性逐漸升高，在完熟時達到最高，此時葉綠素迅速降解。擬南芥基因組中包含3種SGR同系物SGR1/NYE1(At4g22920)、SGR2(At4g11910)和SGRL(At1g44000)。在擬南芥葉片衰老過程中，SGR1以葉綠素a為底物去除鎂離子，而SGRL以脫植基葉綠素a為底物脫去鎂離子，SGR1和SGRL均是促進葉綠素降解的正向調節因子且SGR1發揮關鍵作用[15]。對于擬南芥SGR2的研究目前仍有爭議，Sakuraba等[16]研究發現，不同于SGR1，SGR2的過表達植株為持綠植株，而sgr2-1突變體在鹽脅迫、高溫脅迫、干旱脅迫等非生物脅迫與黑暗誘導處理下表現出早期葉片黃化，這表明SGR2是調節葉片衰老的負向調節因子。Wu等[17]發現在sgr1-1與WT擬南芥植株中過表達SGR2均促使葉片衰老加快，在衰老過程中sgr2-1突變體相對于WT有更多葉綠素得以保留，這表明SGR2是獨立于SGR1之外的與葉綠素降解相關的正向調節因子，同時，啟動子交換實驗表明在葉片衰老過程中SGR2的表達量低于SGR1，這說明SGR1在葉片衰老過程中起主要作用。過表達SGR1、SGRL的水稻植株在黑暗誘導衰老過程中表現出早期的葉片變黃現象，表明水稻中SGRL的功能與SGR1相類似，均能促進葉綠素降解[18]。與擬南芥類似，大豆也包含SGR1/D1、SGR2/D2和SGRL 3種SGR蛋白，而且大豆的d1突變體、d2突變體、d1d2雙突變體均能產生持綠表型，這表明在葉片衰老過程中D1、D2均能促進葉綠素降解[19]。任鈞等[20]認為大豆中受SGR1和SGR2調控的持綠性狀可能是源自于同一個早期變異事件。不同于陸地植物，萊茵衣藻等微細胞藻類的SGR同系物的C端得以延伸，有一個長的親水基，不能歸于SGR亞族與SGRL亞族。萊茵衣藻的SGR蛋白，能在大腸桿菌表達系統中表達促使葉綠素降解，而擬南芥的SGR蛋白不能在大腸桿菌表達系統中表達[21]。

除與葉綠素降解相關外，SGR還具有其他功能。在擬南芥中過表達SGR后，葉綠素a與葉綠素b含量都會下降，而SGR并不能降解葉綠素b，這表明SGR能夠誘導葉綠素b還原為葉綠素a。葉綠素b還原酶可由兩種基因編碼，分別為NYC1與NOL，在擬南芥nyc1突變體與nyc1nol雙突變體中過表達SGR會使葉綠素b降解受阻，而在擬南芥nol突變體與野生型中過表達SGR后葉綠素b均能降解，這表明在擬南芥中過表達SGR會促進NYC1的表達[22]。種子成熟過程中種皮會褪綠，因為葉綠素的殘留不利于種子貯藏，在香蕉和大蕉果的后熟黃化過程中SGR蛋白的活性會逐漸升高[15]，擬南芥的sgr1 sgr2雙突變體與abi3突變體都會產生綠色的種子[16]，在abi3突變體過表達SGR1、SGR2又會使種皮變黃，這表明SGR在種皮褪綠中起關鍵作用。

Fang等[19]通過酵母雙雜交與雙分子熒光互補實驗研究發現，SGR1能直接或間接地與NYC1、NOL、HCAR、PPH、PAO及RCCR這6種葉綠素降解相關酶(CCE)在LHCII中發生生理互作，而且不同SGR蛋白之間還會形成同源或異源二聚體。為研究SGR2的互作能力是否與SGR1相同，他們又同時對SGR1、SGR2進行了酵母雙雜交實驗并通過pull-down實驗驗證，結果表明SGR2與這6種CCEs相互作用的能力受到了很大的限制。在正常衰老葉片的葉綠素降解過程中SGR1與NYC所形成的復合體起主要作用，而在脅迫誘導導致的葉綠素降解衰老過程中SGRL與NOL所形成的復合體起主要作用[16]。這些由SGR、CCEs和LHCⅡ在衰老過程中形成的多蛋白復合物可能是非衰老綠色組織中去除有毒中間產物所必需的[16]。

2SGR與葉綠素代謝

葉綠素及其衍生物在光合作用中起著至關重要的作用，光合作用中的大多數葉綠素分子都能捕獲光能并將其轉移到光合作用中心。大多數綠色植物有兩種不同的葉綠素，葉綠素a和b的生物合成途徑已經得到了廣泛的研究[23]，5-氨基乙酰丙酸在經過諸多反應后合成葉綠素a，在葉綠素合成的最后一步中，一部分葉綠素a在chlorophyllide a oxygenase(CaO)作用下會轉變為7-羥甲基葉綠素a與葉綠素b[14]，但降解途徑目前尚有爭議。葉綠素的降解從葉綠素a開始，葉綠素b含7-羥甲基不能直接被降解，只有轉化為葉綠素a才會被降解[20]。而關于葉綠素a的降解目前認為有兩種途徑：第一種途徑為葉綠素a在降解過程中先脫去鎂離子再脫植醇產生脫鎂葉綠酸a[24]；第二種途徑為葉綠素a在降解過程中先脫去植醇再脫鎂產生脫鎂葉綠酸a[25]。

脫鎂是葉綠素a降解的關鍵一步，是在脫鎂螯合物酶的作用下失去中心鎂離子形成脫鎂葉綠素a并釋放電子[26]，同時脫鎂對photosystem II(PSII)的形成也至關重要，因為PSII的合成始于D1/D2復合體的形成，而脫鎂葉綠素a正是這一復合體不可或缺的組成部分[27]。Park等[14]發現擬南芥中SGR基因編碼了脫鎂螯合物酶，他們將SGR-FLAG重組蛋白導入小麥原生質體中，通過高效液相色譜法檢測葉綠素及其衍生物的含量變化，發現與對照組相比，導入SGR1、SGR2重組蛋白的實驗組葉綠素a含量下降，脫鎂葉綠素a含量上升，導入SGRL重組蛋白的實驗組脫植基葉綠素a含量下降，脫鎂葉綠酸a含量上升。這表明在擬南芥中，SGR1與SGR2是第一種途徑中的脫鎂螯合物酶，能脫去葉綠素a的鎂離子形成脫鎂葉綠素a；SGRL是第二種途徑中的脫鎂螯合物酶，能脫去脫植基葉綠素a的鎂離子產生脫鎂葉綠酸a(圖2)。此外，Matsuda等[21]發現在能夠表達衣藻SGR蛋白的大腸桿菌表達系統中加入葉綠素a后，脫鎂葉綠素a含量增加，當加入葉綠素b或其他葉綠素同系物時，葉綠素及其同系物無明顯變化或變化較小，這表明衣藻SGR能夠特異性的降解葉綠素a。

葉綠素降解過程中產生的脫鎂葉綠酸a會繼續在PAO[8]的作用下氧化產生紅色葉綠素分解代謝物，隨后再通過RCCR(red chlorophyll catabolite reductase)轉變為熒光葉綠素分解代謝物。

3 SGR的調控

SGR1與SGR2的結構相似，SGRL與二者相比稍有差異，因此這3種基因的表達可能會有所不同。擬南芥在正常生長的長日照條件下，SGR1、SGR2的表達水平在4周內迅速上調，而SGRL的表達在前3周呈上升趨勢，之后下降；在黑暗處理下，SGR1、SGR2的表達上調在第3天達到峰值，而SGRL在黑暗中的表達迅速下調[16]。

Chlide a:脫植基葉綠素a； Chlide b:脫植基葉綠素b; Chl a:葉綠素a; Chl b:葉綠素b; Phein a:脫鎂葉綠素a; Pheide a:脫鎂葉綠酸a; RCC:紅色葉綠素分解代謝物; pFCC:熒光葉綠素分解代謝物; CaO:葉綠素a氧化酶; CS:葉綠素合成酶; CBR:葉綠素b還原酶; HCAR:7-羥甲基葉綠素a還原酶; CLH:葉綠素酶; SGR:脫鎂螯合物酶; PPH:脫鎂葉綠素酶; PAO:脫鎂葉綠酸a加氧酶; RCCR:紅色葉綠素降解產物還原酶

圖1 葉綠素代謝途徑
Figure 1 Chlorophyll metabolic pathway

SGR的表達受到轉錄因子的調控，如WRKY與NAC。WRKY 53是一種由H2O2誘導的氧化還原敏感基因，它通過反饋編碼一種自身調節其自身合成的轉錄因子[28]。WRKY 53能與衰老相關基因相互作用，下調WRKY 53的表達水平會延緩衰老。生物信息學分析表明這種轉錄因子是衰老調控網絡中的一種早期作用成分，可能會調節SGR基因的表達。對NAC轉錄因子的研究發現，小麥6號染色體上的NAC轉錄因子基因GPC正向調節衰老起始[29]。下調GPC的轉錄水平，會使小麥葉片衰老延遲24 d，這表明NAC可能會調節SGR的表達。進一步研究發現，在擬南芥中有3種NAC轉錄因子ANAC046、ANAC087和ANAC100可以直接結合到NYC1、SGR1、SGR2與PAO的啟動子區域，從而調控這些葉綠素降解相關酶基因的表達，其中ANAC046是葉片衰老的正調節因子[30]。

ABI3、ABI5、EEL都是ABA信號相關轉錄因子，ABI3能與SGR1、SGR2啟動子區域的B3結構域(CATGCA)結合[31]，在黑暗誘導衰老條件下，光敏色素相互作用因子PIF4與PIF5能明顯激活SGR1的表達。在依賴PIF4/PIF5調控衰老的葉片中，ABI5與EEL能直接結合到SGR1啟動子區域的ABA響應元件結構域(YACGT)上。除此之外，ABA響應元件結合因子ABF2/3/4也能調控SGR1的表達。這表明ABA信號在SGR1表達的激活和葉綠素降解中起著重要的作用。有意思的是，在黑暗誘導衰老下，NYC1也能直接被ABI5、EEL轉錄因子激活，在種子成熟褪綠過程中ABF4也起到調控作用。在水稻中ABA信號相關轉錄因子OsNAP直接激活SGR1與NYC1的轉錄，從而促進SGR1與NYC1的表達，并對葉片衰老與種子褪綠起重要作用[11]。

植物葉片衰老受到激素的調節[32]，細胞分裂素能夠抑制衰老，擬南芥ore12-1是一種功能型持綠突變體，它的細胞分裂素受體基因AHK3不需要其他因子的誘導能夠穩定表達，而有的擬南芥持綠突變株系在衰老過程中對乙烯的反應延遲[29]。Jiang等[5]通過激素離體處理水稻幼苗葉片發現，脫落酸會促進SGR的表達，而細胞分裂素則會抑制SGR的表達，這表明SGR的表達還受外源激素的調節。

4 展望

20世紀初，育種家在品種選育時兼顧了高產性與持綠性,到了20世紀70年代末，持綠性已經被明確確定為玉米等商品糧的優良特性，持綠品種具有巨大的市場潛力[4]。SGR基因在植物葉綠素降解和持綠品種的挖掘中起重要作用，雖然近年來SGR基因的功能與表達模式已被廣泛研究，但僅限于擬南芥、水稻等模式作物中，我國主要糧食作物小麥、玉米等的SGR基因結構與功能尚不清楚，還需要進一步研究。今后應主要圍繞4個方面展開研究：1)利用祖先物種區分小麥等異源多倍體作物每個染色體組的SGR序列，以此來確定進化規律；2)對SGR基因的表達模式進行分析，研究SGR基因的表達部位、表達量與葉片衰老時期的關系；3)構建RNAi、CRISPR-Cas9及過表達載體進行轉基因功能驗證，與此同時利用高效液相色譜法檢測葉綠素及其代謝產物的含量；4)利用酵母雙雜交、雙分子熒光互補、免疫共沉淀等方法來確定SGR蛋白與葉綠素降解相關蛋白的相互作用。

隨著研究的深入，作物衰老的分子機制必將會更加明晰，利用分子育種手段選育持綠型作物品種將具有廣闊的前景。