牡蠣諾如病毒多樣性研究中病毒富集方法的評估

郭 萍， 潘迎捷，2， 喻勇新,2

(1. 上海海洋大學 食品學院， 上海 201306；2. 農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室， 上海 201306)

諾如病毒(Norovirus，NoV)，又稱為諾瓦克病毒，于1968年在美國俄亥俄州諾瓦克地區的一所學校中暴發的一起流行性腹瀉的患者糞便中發現，因此而得名[1-4]。諾如病毒是單股正鏈的RNA病毒，屬于杯狀病毒科，主要分為7個基因類群，其中GI、GII、GIV型諾如病毒可以感染人類[5-6]，由于GIV型諾如病毒沒有GI和GII型流行，故一般著重于GI和GII型諾如病毒的研究，在GI和GII基因類群中，又可以分別細分出至少9和21種基因型。

諾如病毒在環境中傳播的主要載體是以牡蠣為代表的雙殼軟體動物[7]。貝類中NoV污染不但危害人體健康，還嚴重影響我國的水產貿易[8-11]。研究發現，牡蠣中幾乎含有所有的GI型和大部分GII型諾如病毒[18]，通過對牡蠣中諾如病毒多樣性的探究，可以更加了解牡蠣中諾如病毒的感染情況，有助于今后對海產品諾如病毒污染的監測和防控。

目前，對于牡蠣中RNA提取的方法有很多，但是大部分都關注諾如病毒檢測工作，還沒有一個較好的用于后期宏基因組測序的提取方法，這需要所提取的RNA盡可能覆蓋整個生物群體，諾如病毒損失率盡可能低。因此本實驗對4種常用宏基因組學研究中病毒富集方法(PEG6000沉淀法、超速離心法、過濾法和直接提取法)[12-15]進行評估，通過加入一定量含有GII.4型諾如病毒基因的慢病毒(Lentivirus)到預先檢測為不含諾如病毒的牡蠣消化腺中，經過4種方法處理后提取RNA，利用一步法反轉錄熒光定量PCR對提取的RNA中Lentivirus進行定量，通過計算回收率來評估4種方法。同時為了進一步驗證4種方法是否有利于去除微生物污染，采用16S rRNA通用引物對最后提取的RNA進行反轉錄PCR進行驗證。目的是為了探尋一種最適用于后續牡蠣中諾如病毒多樣性研究中RNA提取的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 Lentivirus和GII型諾如病毒熒光定量PCR探針引物 帶有GII.4 基因的Lentivirus 合成于深圳市百恩維生物科技有限公司；GII型諾如病毒熒光定量PCR探針(Ring2)引物(COG2F/COG2R)合成于寶生物工程(大連)有限公司,引物探針序列如表1所示。

1.1.2 試劑及儀器 1×PBS磷酸鹽緩沖液、聚乙二醇6000(PEG6000)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購于上海生工生物公司；0.45 μm和0.22 μm濾膜濾器購于密理博中國有限公司；動物總RNA快速提取試劑盒(貨號：GK3015)購于上海捷瑞生物工程公司；一步法反轉錄試劑盒(貨號：RR055A)，PCRTaq聚合酶購于寶生物工程(大連)有限公司；小型高速冷凍離心機、高速冷凍離心機、PCR儀、移液槍均采購于德國艾本德公司(Eppendorf); MP破碎儀購于美國MP生物公司; 一步法反轉錄q-PCR試劑盒(貨號：4392656)購于美國ABI生物公司。

1.1.3 采樣 新鮮太平洋牡蠣采集于上海市蘆潮港水產市場(每只約150 g)，處于低溫條件立即帶回實驗室。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 按動物總RNA快速提取試劑盒說明書進行提取。

1.2.2 反轉錄巢氏PCR(Nested RT-PCR) 反轉錄巢氏PCR分為反轉錄PCR(RT-PCR)和巢氏PCR(nested PCR)。RT-PCR具體操作為：1 μL 的逆轉錄酶(酶保存在甘油中，吸取和吹打都要緩慢進行，以免造成人為誤差)，12.5 μL的2×RT-PCR 緩沖液，0.5 μmol/L的GI和GII型正反向引物(表1)于PCR小管中，加入30 ng的 RNA 模板后，最終以RNase-free ddH2O補足至25 μL。RT-PCR的程序如下：首先50℃下反轉錄30 min，在反轉錄酶的作用下，將單鏈 RNA 反轉錄成 cDNA(complementary-DNA)，緊接著94℃預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環。Nested PCR具體操作為：將第一輪 RT-PCR的產物稀釋10倍作為第二輪PCR的模板。第二輪PCR體具體操作為：將第一輪 RT-PCR的產物稀釋10倍作為第二輪PCR的模板。第二輪PCR體系配方如下：分別取 12.5 μL的2×PCR緩沖液，1 μmol/L的GI和GII型正反向引物(表1)，1 μL的模板于 PCR 小管中，最終用RNase-free ddH2O補足至25 μL。第二輪PCR的程序如下：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火保持30 s，72℃延伸30 s；35個循環。最后在72℃下保溫15 min加poly-A 尾，以便后續的 TA 連接和測序。

1.2.3 牡蠣中諾如病毒檢測 從水產市場采集完牡蠣后立即在超凈工作臺中對其解剖得到整只消化腺，用MP組織破碎儀將消化腺破碎均勻(轉速：6 M/S；時間：30 s)，平均分成幾等分分裝，每份50 mg，保存于-80℃冰箱。取一份牡蠣消化腺按照1.2.1所述的方法提取RNA。利用1.2.2的方法對所提 RNA進行諾如病毒檢測，通過2%的瓊膠電泳觀察是否產生陽性GI和GII的PCR產物條帶。

1.2.4 一步法反轉錄熒光定量PCR 通過反轉錄熒光定量PCR對Lentivirus拷貝數進行定量，20 μL反應體系為:10 μL 2×RT mix buffer, 1.8 μL 10 μmol/L的正反向引物(COG2F/COG2R), 0.5 μL 10 μmol/L的探針(Ring 2),0.5 μL的RT-Enzyme，2 μL RNA模板和3.4 μL的ddH2O。反應程序為：42℃預變性15 min;95℃變性10 min，95℃退火15 s，60℃延伸60 s，40個循環。在60℃收集熒光信號。

將108copies/μL GII型諾如病毒RNA標準品進行倍比稀釋, 共稀釋7個梯度，分別為107～101copies/μL。每個梯度的RNA標準品當作模板加入熒光定量PCR的反應體系中來制備絕對定量標準曲線。

表1 PCR引物

注：a為引物5′端在序列M87661的位置；b為引物5′端在序列X86557的位置

1.2.5 病毒富集方法比較 取2 g陰性牡蠣消化腺加入1 μL的Lentivirus,用18 mL的1×PBS將消化腺混勻，在4℃下8000 r/min離心20 min，取上清，并將上清均分為兩部分。方法1(PEG6000沉淀法):取一部分的上清加入PEG6000至2%的終濃度，4℃孵育18 h，緊接著在4℃下8000 r/min離心20 min，棄上清，用100 r/min的Tris-HCl將沉淀重旋，提取RNA；方法2(過濾法)：將另一部分的上清連續過0.45 μm和0.22 μm后，取濾液提取RNA；方法3(超速離心法)：將方法2中過完膜的濾液9000 g超速離心4 h，棄上清，用100 μL的Tris-HCl將沉淀重旋，提取RNA；方法4(直接提取法)：取2 g陰性牡蠣消化腺加入1 μL的Lentivirus后，直接提取RNA。圖1為本過程的流程圖，對4種方法提取的病毒RNA進行一步法反轉錄熒光定量PCR(如1.2.3所述)來計算Lentivirus的數量。

圖1 4種方法流程圖

1.2.6 16S PCR檢測 以1.2.5提取的RNA為模板，用引物27F/1492R來進行RT-PCR反應，進行16S檢測，將PCR反應產物通過2%的瓊膠電泳來觀察條帶的亮弱。

25 μL PCR反應體系如下：12.5 μL的2×RT-PCR buffer， 27F(10 mmol/L)和1492R(10 mmol/L)各1 μL，30 ng RNA模板，RNase-free ddH2O補足至25 μL。

PCR反應程序如下：50℃反轉錄30 min；95℃預變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環；最后再72℃延伸10 min。

2 結果與分析

2.1 牡蠣中諾如病毒檢測

在2%的瓊膠電泳觀察是否產生陽性GI和GII的PCR產物(GI:330 bp,GII:343 bp)。如圖2膠圖所示，無諾如病毒GI型或者GII型目的條帶產生，由此選擇該只牡蠣消化腺為實驗樣品，定義為陰性牡蠣。

Nested RT-PCR的瓊脂凝膠電泳圖：M為DNA分子標尺(100 bp)；GI為GI型諾如病毒檢測結果；GII為GII型諾如病毒檢測結果；N為陰性對照

圖2 牡蠣檢測結果

Figure 2 Result of oyster detection

2.2 反轉錄熒光定量PCR

Lentivirus的起始數量如圖3-a、b顯示，圖3-a所示標準曲線R2為0.996，擴增效率為100.057%。圖3-b所示原液和稀釋10倍的Lentivirus都得到一個良好的擴增曲線，即Lentivirus的起始拷貝數為1.00×105copies/μL。

經過4種方法處理后得到的Lentivirus的數量如圖3-c、d顯示，圖3-c所示標準曲線R2為0.999，擴增效率為100.889%。圖3-d為4種不同處理后的擴增曲線，效果良好。由計算結果可知：方法1中Lentivirus的數量為2.17×103copies/μL；方法2為2.65×103copies/μL；方法3為1.03×103copies/μL；方法4為2.83×103copies/μL。圖3-e、f為第2次重復性實驗結果，圖3-e所示標準曲線為0.997,擴增效率為100.125%。由圖3-f的擴增曲線計算結果可知：方法1中Lentivirus的數量為2.20×103copies/μL；方法2為2.70×103copies/μL；方法3為1.27×103copies/μL，方法4為2.75×103copies/μL。由這兩次重復性實驗可知，計算結果相差不大，具有真實可靠性。

a、b:Lentivirus定量的標準曲線與擴增曲線；c、d：第一次方法評估結果的標準曲線與擴增曲線；e、f:第二次方法評估結果的標準曲線與擴增曲線

圖3 熒光定量PCR結果

Figure 3 Result of RT-q PCR

利用熒光定量PCR的方法對Lentivirus起始拷貝數和經過4種方法提取后的Lentivirus進行定量，通過對比前后數量變化計算出Lentivirus回收率(表2)，由兩次重復實驗可知這4種方法的Lentivirus回收率無明顯區別，相比較而言方法1的回收率高于剩余其他3種方法，可初步判斷方法1的效果優于另外3種方法。

2.3 16S PCR檢測

將經過4種不同方法提取的RNA用16S RT-PCR的方法進行檢測，通過2%的瓊膠電泳條帶的亮弱來反映細菌的污染程度，圖4所示兩次重復性實驗結果，可看出經過這4種方法處理后都存在著一定程度的細菌污染，而方法4的條帶稍亮于其他方法的條帶，由此可說明方法4存在著相對較強的細菌污染。

表2 4種方法回收率的計算

M:DNA分子標尺(200 bp)；1～4：分別代表4種不同方法；N:陰性對照

圖4 16S PCR檢測結果

Figure 4 The result of 16S PCR

3 討論

諾如病毒具有很強的感染能力，感染劑量大約為10到100個病毒顆粒，具有傳播快的特點。而牡蠣作為諾如病毒環境傳播的主要載體和濾食性動物，具有富集諾如病毒的作用，目前越來越多的人因為生食或半熟的牡蠣而感染諾如病毒。傳統的RT-PCR方法并不能反映諾如病毒的流行病學[12]，通過利用宏基因組學探究牡蠣中諾如病毒的多樣性，不僅有助于監測海產品污染情況，還可以探尋諾如病毒與環境中潛在有助于感染的微生物的關系，更好地了解諾如病毒的傳播[16]。因此探尋一種最適用于牡蠣諾如病毒多樣性研究中RNA提取的方法則顯得至為重要。

在本文中，為了更好地保證牡蠣RNA提取效果，我們針對目前市面上常有的3款RNA提取試劑盒(捷瑞，GK3015；天根，DP431；凱捷，74904)進行了比較，根據RNA瓊脂糖凝膠電泳圖發現捷瑞(GK3015)試劑盒提取的牡蠣RNA含量最高，且高濃度的proteinase K可以提高RNA的提取效率，凱捷試劑盒提取牡蠣中RNA的結果最差，因此將捷瑞試劑盒用于本實驗中提取。此外，由Lentivirus回收率結果可知方法4>方法2>方法1>方法3, 而根據核酸凝膠電泳圖條帶亮弱可得細菌污染程度為方法4>方法2>方法1>方法3。可見在提取RNA時，對樣品預處理過程越多會導致病毒損失率相應增加，但是這個富集過程在去除細菌污染方面具有一定的效果。對于后續多樣性分析研究中，可能會由于缺少富集方法而導致它具有較為嚴重的細菌污染，對后期宏基因組測序產生一定的影響，但是更重要的是直接提取法相對較高的回收率可以更好地反映牡蠣中諾如病毒的多樣性，尤其是在牡蠣樣品中，諾如病毒顆粒數目與其他微生物相比只具有很小的比例，減少病毒損失就顯得尤為重要。

通過比較4種目前常用于宏基因組測序的牡蠣中病毒富集方法，評價出一種效果相對較好的方法運用于牡蠣樣品中，可能存在一定的實驗偏差，但為后期順利進行牡蠣中諾如病毒的多樣性研究提供科學依據。