掌葉覆盆子套種對板栗林土壤細菌群落結構演變及多樣性的影響

徐 陽， 龔榜初， 吳開云， 江錫兵， 孫維敏， 胡衛濱， 陳喜良

(1. 中國林科院亞熱帶林業研究所, 杭州 311400； 2．浙江省林木育種技術研究重點實驗室, 杭州 311400； 3. 浙江省金華武義縣林業科技推廣站, 金華 321200； 4. 浙江萬壽康生物科技有限公司, 金華 321200)

板栗(Castaneamollissima)是我國重要的特色堅果，栽培歷史久，種植面積廣，但目前栗園普遍低產低效[1-2]。掌葉覆盆子(Rubuschingii)為薔薇科懸鉤子屬落葉灌木，果實具有固精、益腎等保健功能[3-4]，市場需求增大，極具推廣價值[4-5]。充分利用板栗林下豐富的空間、土壤與水源條件，改變單一種植模式，進行掌葉覆盆子套種，短期內可產生較高經濟效益[5]。但板栗-掌葉覆盆子復合模式中土壤養分及土壤生態等指標，尚未開展系統評價，科學而可持續的經營技術體系尚未建立。

土壤細菌參與土壤有機質分解、養分轉化[6]，其群落結構關系到土壤的可持續利用和抗壓力，是土壤養分、質量和生態評價的重要指標[7]。近年來，成熟的宏基因組高通量測序技術為土壤細菌群落結構演變及多樣性研究提供了堅實的技術保障。目前，雖板栗共生菌根真菌研究較為深入[8-9]，但板栗林土壤細菌方面的研究，尚處于起步階段。徐秋芳等研究發現集約栽培的板栗林，頭10年里，土壤微生物群落功能多樣性下降趨勢明顯，10年后則變化不大[10]。秸稈腐解物覆蓋經營可顯著影響板栗林土壤氨化細菌、真菌、放線菌數量[11]。而關于板栗林土壤細菌結構的研究則鮮有報道。為此，本文采用高通量測序技術，從微觀角度闡述不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤養分及細菌群落結構變化，為生產中板栗-掌葉覆盆子復合經營技術提供依據，為科學評價該種植模式的生態風險提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗處理與材料

試驗地位于浙江省金華市武義縣王宅鎮。10年生板栗林，林相整齊，主栽品種為毛板紅(CastaneamollissimaBL Maobanhong)。于海拔700～800 m處，選擇土壤類型、質地相似的3個地塊，每地塊約4畝。2014年冬，林下整地，2015年春，掌葉覆盆子分株栽植，分別設置板栗純林模式(0株掌葉覆盆子/畝，CM)、低密度掌葉覆盆子的板栗-復合模式(100株掌葉覆盆子/畝，CMRC1)及高密度板栗-復合模式(400株掌葉覆盆子/畝，CMRC2)。

1.2 取樣方法

2017年夏，掌葉覆盆子進入穩產成熟期。 2017年10月底，分別在CM、CMRC1與CMRC2模式地塊內，每模式選定3個采樣區(每樣區20 m×20 m)，采樣區內以Z型選5個樣點，采集0～20 cm深的土樣，混合均勻，共計9份土樣。土樣去除石礫和植物殘體，過2 mm鋼篩后分2份保存: 一份冷凍，用于提取土壤細菌DNA; 另一份室內自然風干，用于土壤基本理化分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤因子檢測

委托國家林業局經濟林產品質量檢驗檢測中心(杭州)按常規法分別測定土壤中水溶性鹽分含量、有機質含量、全氮含量、水解性氮含量、全磷含量、有效磷含量、全鉀含量、速效鉀含量、交換性鈣含量、交換性鎂含量、pH值。

1.3.2 土壤細菌16S rDNA基因測序

采用 Fast DNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals, USA)試劑盒，分別提取9個土樣細菌總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳及Agilent 2100 Bioanalyzer、超微量分光光度計檢測DNA的質量與濃度，合格的DNA稀釋為10 ng/μL，于-20℃冰箱保存備用。

取10 ng土壤DNA為模板，設計16S rDNA V4-V5區特定引物擴增特異區域，委托南京集思慧遠生物工程有限公司采用Illumina Hiseq 2500平臺，采用PE250測序策略進行高通量測序。

1.4 數據分析

原始序列質控后，用Usearch軟件[12]進行去嵌合體、聚類和隨機抽平處理，以97%相似度為標準，提取對應OTUs (Operational Taxonomic Units)。利用QIIME軟件[13]對抽平后的OTUs進行分析，對每個OTU進行物種分類。歸類后，根據每個OTU中序列的條數，從而得到OTU豐度表，最后根據該OTU豐度表進行后續分析。

采用SPSS16.0軟件進行DUNCAN新復極差法比較，各指標用不同大寫字母表示差異顯著 (P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 土壤環境因子分析

表1顯示，掌葉覆盆子套種后，板栗林土壤有機質及全氮、水解性氮、有效磷、全磷含量增加，但隨套種密度提升，又顯著回落。其中土壤有機質及水解性氮最明顯，有機質從CM中23.57 g/kg上升到CMRC1中的37.13 g/kg，套種密度升高后，又回落到26.67 g/kg。土壤水解性氮含量從CM中122.33 mg/kg上升到CMRC1中的301.67 mg/kg，掌葉覆盆子密度升高后，也回落到145.67 mg/kg，但仍顯著高于板栗純林。土壤全鉀與速效鉀含量隨掌葉覆盆子密度提升反而呈現下降趨勢，其中速效鉀含量從CM中58.73 mg/kg顯著下降到CMRC1中的45.10 mg/kg，密度升高后，又顯著下降到35.23 mg/kg。土壤交換性鈣與交換性鎂含量則在掌葉覆盆子密度在400株/畝時，從純林和低密度的46.93、28.63 mg/kg與10.7、13.73 mg/kg分別顯著升高到210.33與79.43 mg/kg。

2.2 土壤細菌序列分析

對3個處理(9樣本)的土壤細菌進行16S rDNA高通量測序，分別得到25 976～39 100條序列。將序列抽平至18 296條后，在97%的相似水平下，共獲得6414個 OTUs。抽平后，所有土壤樣本OUTs數目均介于2071～2724之間。各樣品測序覆蓋率均在0.93 以上，表明樣品序列測序量足以覆蓋樣品菌群組成，序列未測到概率低。

表1 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤理化性質

2.3 掌葉覆盆子套種對板栗林土壤細菌豐度及多樣性的影響

OTUs維恩圖(圖1)表明，各模式樣品共有OTUs數量為980個。CMRC2樣本特異性OTUs數量最多，為1010個，CM特異性OTUs數量最少，為674個，表明不同種植模式土壤細菌多樣性存在一定差異。

表2 土壤細菌群落結構多樣性指數

圖1 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤細菌群落 OTUs 維恩圖
Figure 1 Venn diagram of bacterial OTUs of Chestnut soil with different inter-planting densities of Raspberry

樣本多樣性指數(表2)顯示，板栗-掌葉覆盆子模式(CMRC1、CMRC2)的土壤微生物 Chao1指數(3859.58、3985.08)顯著高于板栗純林(CM，3133.97)，但兩種套種模式間Chao1指數差異不顯著，表明套種掌葉覆盆子后，能顯著提高板栗林土壤細菌豐富度，但掌葉覆盆子密度對土壤細菌影響不顯著。Shannon指數隨掌葉覆盆子套種密度提高呈增勢，但不顯著，表明板栗林土壤微生物多樣性較穩定，一定密度的掌葉覆盆子套種對其影響不顯著。低密度套種掌葉覆盆子的板栗林Simpson 指數與板栗純林差異不顯著，而套種掌葉覆盆子在400株/畝左右時，Simpson指數為0.992，顯著高于其他模式，顯示此時的土壤微生物優勢種突出，但土壤多樣性顯著下降。

2.4 掌葉覆盆子套種對板栗林土壤主要細菌群落結構的影響

門分類水平上，板栗林土壤細菌分布在20個已知細菌門。各處理優勢細菌群落組成基本一致。板栗純林土樣中屬于變形菌門(Proteobacteria)與酸桿菌門(Acidobacteria)的序列分占全部序列的31.20%和29.70%，放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)與疣微菌門(Verrucomicrobia)序列占6%～8%，這6門的序列總比例達89%左右，為板栗林土壤中優勢菌落。此外各模式土壤中芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)與厚壁菌門(Firmicutes)序列比例也在1%以上。

精確到目水平，板栗純林土壤樣本中屬于變形菌門的弧菌目(Vibrionales，7.80%)、根瘤菌目(Rhizobiales，5.53%)、紅螺菌目(Rhodospirillales，3.38%)、黏球菌目(Myxococcales，2.23%)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales，2.61%)、亞硝化單胞菌目(Nitrosomonadales，2.08%)、伯克氏菌目(Burkholderiales，2.43%)及浮霉菌門的浮霉菌目(Planctomycetales，7.20%)，酸桿菌門的酸桿菌目(Acidobacteriales，6.38%)，疣微菌門纖線桿菌目(Ktedonobacterales)芽單胞菌門的芽單胞菌目(Gemmatimonadales，1.97%)及Solibacterales(5.94%)、Subgroup 10(1.87%)的菌種總和占總比例的50%以上，為目層次上的優勢菌落。

分別在門與目水平對各模式土壤細菌群落構建分層聚類圖(圖2)，3個模式土樣均明顯地分成2大類。門水平上，板栗純林土壤單獨為一支；掌葉覆盆子套種的2個栗林土壤細菌群落結構較接近，聚為一支。而目水平上，低密度和無掌葉覆盆子套種的土壤細菌群落結構較接近，聚為一支；高密度套種的土壤樣本單獨為一支。這或許暗示了掌葉覆盆子套種對土壤細菌群落結構在門水平上影響較大，而套種掌葉覆盆子需在達到一定密度后，才在目水平上對土壤細菌群落結構產生較大影響。

由圖2和圖4進一步分析掌葉覆盆子套種對板栗林土壤細菌豐度的影響。門水平上，土壤細菌豐度顯著變化同樣主要出現套種掌葉覆盆子后，其中酸桿菌門、放線菌門、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、疣微菌門與芽單胞菌門細菌豐度顯著上升，但高密度掌葉覆盆子套種下酸桿菌門略有回落；變形菌門與浮霉菌門細菌豐度明顯下降，但隨密度提高，略有上升。而綠彎菌門細菌豐度呈先升高后下降的趨勢。目水平上，土壤細菌豐度隨掌葉覆盆子套種密度呈顯著變化(圖3和圖5)。弧菌目、浮霉菌目、根瘤菌目、伯克氏菌目在掌葉覆盆子套種后豐度顯著下降，其中弧菌目變化最明顯，從板栗純林CM中7.80%顯著下降到CMRC1中0.46%，掌葉覆盆子密度增加后，顯著下降到0.005%。紅螺菌目、黏球菌目與芽單胞菌目在掌葉覆盆子套種后豐度顯著上升。而Solibacterales、黃色單胞菌目、亞硝化單胞菌目、纖線桿菌目、Subgroup 10則在高密度掌葉覆盆子套種時才發生顯著變化，其中Solibacterales、Subgroup 10、黃色單胞菌目、亞硝化單胞菌目顯著增高，而纖線桿菌目顯著降低。酸桿菌目細菌豐度(6.38%)隨掌葉覆盆子套種密度呈先升高(7.87%)后下降(6.27%)的趨勢。

圖中左側聚類樹為物種聚類樹; 上方為樣品聚類樹; 熱圖顏色表示每行細菌門標準化后的相對豐度

圖 2 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤細菌門分層聚類
Figure 2 Hierarchical clustering analysis for bacterial phylum community in Chestnut soil with different inter-planting densities of Raspberry

圖中左側聚類樹為物種聚類樹; 上方為樣品聚類樹; 熱圖顏色表示每行細菌目標準化后的相對豐度

圖 3 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤細菌目分層聚類
Figure 3 Hierarchical clustering analysis for bacterial order community in Chestnut soil with different inter-planting densities of Raspberry

2.5 土壤細菌與土壤因子RDA分析

分別在門和目水平上分析土壤細菌種群與環境因子關系。排序圖(圖6)前兩軸可解釋栗林土壤細菌群落變異程度的95.4%及94.6%，表明土壤環境因子對細菌群落結構影響較大，排序軸前兩軸能真實地反映環境因子對細菌群落的影響程度，其中，土壤水溶性鹽分含量(r=-0.802)、有效磷含量(r= 0.864)、全鉀含量(r=-0.637)、速效鉀含量(r=-0.946)、交換性鈣(r= 0.909)以及交換性鎂(r= 0.955)與軸1相關性較大。

圖 4 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤各門細菌相對豐度圖Figure 4 The relative abundance of bacterial phylum in Chestnut soil with different interplanting densities of Raspberry

圖 5 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤各目細菌相對豐度圖Figure 5 The relative abundance of bacterial order in Chestnut soil with different inter-planting densities of Raspberry

門水平上，RDA三序圖(圖6-A)顯示綠彎菌門、GAL15、Ignavibacteriae與土壤水溶性鹽分含量相關性最大；變形菌門、厚壁菌門、藍藻門、浮霉菌門與土壤速效鉀含量相關性較大；酸桿菌門與土壤水解性氮相關性最大；Latescibacteria、硝化螺旋菌門、綠彎菌門與土壤有機質含量相關性最大；疣微菌門、迷蹤菌門則與掌葉覆盆子密度密切相關，奇古菌門、芽單胞菌門、裝甲菌門、放線菌門與土壤交換性鈣含量密切相關。目水平上(圖6-B)，纖線桿菌目與土壤水溶性鹽分含量相關性最大；酸桿菌目、Blastocatellales與土壤全氮含量、土壤水解性氮含量密切相關；弗蘭克氏菌亞目、硫還原菌目與土壤有機質含量密切相關；芽單胞菌目、紅螺菌目、黏球菌目與土壤有效磷含量相關性最大；黃色單胞菌目、亞硝化單胞菌目與土壤交換性鈣含量密切相關；Chthoniobacterales、Solirubrobacterales與土壤pH值密切相關。

RDA三序圖也表明：門水平上，板栗純林樣本均聚集在右側，而高密度和低密度掌葉覆盆子套種樣本則共同聚集在左側。而目水平上，各模式內樣本明晰地分聚在一起。浮霉菌目、根瘤菌目、伯克氏菌目、弧菌目、伯克氏菌目與板栗純林的3個樣本(CM1、CM2、CM3)分布相關密切。酸桿菌目、Blastocatellales與CMRC1樣本(CMRC1.1、CMRC1.2、CMRC1.3)分布密切相關。Solibacterales、Subgroup 10、黃色單胞菌目、亞硝化單胞菌目細菌與CMRC2樣本(CMRC2.1、CMRC2.2、CMRC2.3)分布密切相關。

D：掌葉覆盆子密度、WS：土壤水溶性鹽分含量、OM：土壤有機質含量、TN：土壤全氮含量、HN：土壤水解性氮含量、AP：土壤有效磷含量、TP：土壤全磷含量、TK：土壤全鉀含量、Ak：土壤速效鉀含量、ECa：土壤交換性鈣含量、EMg：土壤交換性鎂含量、pH：土壤pH值。1：CM1、2：CM2、3：CM3:、4：CMRC1.1、5：CMRC1.2、6：CMRC1.3、 7：CMRC2.1、8：CMRC2.2、9：CMRC2.3。優勢細菌門(A圖)。Acid：Acidobacteria酸桿菌門、Prot：Proteobacteria變形菌門、Acti：Actinobacteria放線菌門、Chlo：Chloroflexi綠彎菌門、Plan：Planctomycetes浮霉菌門、Verr：Verrucomicrobia疣微菌門、Gemm：Gemmatimonadetes芽單胞菌門、Bact：Bacteroidetes擬桿菌門、Nitr：Nitrospirae硝化螺旋菌門、Firm：Firmicutes厚壁菌門、Arma：Armatimonadetes裝甲菌門、Elus：Elusimicrobia迷蹤菌門、Cyan：Cyanobacteria藍藻門、 GAL1：GAL15、Thau：Thaumarchaeota奇古菌門、Late：Latescibacteria、Igna：Ignavibacteriae、Chla：Chlamydiae衣原體門、Tect：Tectomicrobia、Chlo：Chlorobi綠菌門。優勢細菌目(B圖)。Plan：Planctomycetales浮霉菌目、Rhiz：Rhizobiales根瘤菌目、Acid：Acidobacteriales酸桿菌目、Soli：Solibacterales、Rhod：Rhodospirillales紅螺菌目、Myxo：Myxococcales黏球菌目、Xant：Xanthomonadales黃色單胞菌目、Nitr：Nitrosomonadales亞硝化單胞菌目、Kted：Ktedonobacterales纖線桿菌目、Gemm：Gemmatimonadales芽單胞菌目、Burk：Burkholderiales伯克氏菌目、Subg：Subgroup 10、Fran：Frankiales弗蘭克氏菌亞目、Nitr：Nitrospirales硝化螺旋菌目、Gaie：Gaiellales、Blas：Blastocatellales、Vibr：Vibrionales弧菌目、Chth：Chthoniobacterales、Desu：Desulfurellales硫還原菌目、Soli：Solirubrobacterales

圖6 優勢細菌門(A)和優勢細菌目(B)與土壤環境因子冗余分析

Figure 6 Redundancy analysis on soil dominant bacteria phylum (A) and soil dominant bacteria order (B) constrained by soil variables

3 討論

3.1 掌葉覆盆子套種對栗林土壤環境因子的影響

栗園套種藥材后，耕作更為細密，對林地土壤理化性質有一定的改良作用，但不同養分改良效益存在差異。林下套種掌葉覆盆子后，增加了林分地被物及凋落物，固定了土壤養分[14]，從而使土壤有機質、全氮、水解性氮、有效磷、全磷含量顯著增加。較高的氮元素含量，也相應降低了土壤pH值。但套種密度提升后，板栗-掌葉覆盆子系統中元素需求增加，土壤有機質、水解性氮含量有所回落。鉀元素為果實發育中關鍵元素[15-16]，在掌葉覆盆子開花結實過程中大量消耗，于是系統中土壤鉀元素隨套種密度提升而顯著下降的趨勢更為明顯。這些或許暗示林地套種結果作物在改良土壤的同時，也增加了系統元素需求負荷，生產中需合理控制套種密度并適時增施肥料。

3.2 掌葉覆盆子套種對栗林土壤細菌群落的影響

門分類水平上，各模式細菌組成較一致，但各門相對豐度不同。板栗純林土壤優勢菌種為變形菌門(31.2%)與酸桿菌門(29.7%)，其他，放線菌門、綠彎菌門、浮霉菌門與疣微菌門也均為森林土壤的常見門類[17]。與其他研究一致[17-18]，板栗純林土壤中變形菌門數量最高，主要為弧菌目(7.8%)、根瘤菌目(5.53%)、紅螺菌目(3.38%)、黏球菌目(2.23%)、黃色單胞菌目(2.61%)。其中紅螺菌目多為光合細菌和固氮細菌，對生態系統氮的穩定性和土壤能量的平衡起重要作用[19]。而弧菌目、根瘤菌目、黃色單胞菌目多是植物的病原體，能夠導致農作物病害[20]，這些目細菌在板栗純林土樣中存在較高含量，或許與板栗純林長年種植后，土壤中病原菌數量大量增加，益生菌數量下降等土壤遭受脅迫有關[21-22]。板栗林土壤中酸桿菌門相對含量與亞馬遜原始森林等森林土壤(20%～30%)相當[23-24]，而高于農田土壤樣本中13%～24%的含量[25-26]，也與板栗林中變形菌門數量相當。通常，酸桿菌門是土壤中僅次于變形菌門的第二大微生物類群，板栗林土壤中酸桿菌含量的提升或許和較高海拔的分布有一定關系[24]。

土壤細菌Chao1指數與分層聚類均表明，掌葉覆盆子套種可對栗林土壤細菌門群落產生影響。套種一定密度掌葉覆盆子后，才在目水平上對土壤細菌群落結構產生較大影響。這或許是套種后，土壤養分含量顯著增大，促進了土壤細菌的繁殖[19, 27]。正如數據顯示，土壤細酸桿菌門與放線菌門、迷蹤菌門、疣微菌門、芽單胞菌門細菌以及變形菌門的紅螺菌目與黏球菌目豐度顯著上升。套種掌葉覆盆子后，同時也優化了土壤細菌結構[28]，弧菌目、黃色單胞菌目、根瘤菌目等有害菌數量減少，其中，弧菌目最為明顯，從CM樣本中的7.8%驟減到CMRC1中的0.46%及CMRC2中的0.005%。而高密度套種下，土壤養分結構等較板栗純林有較大改變，Simpson指數顯著提高，土壤細菌優勢度增加，多樣性下降，使得土壤細菌豐度及組成結構在目水平上重新調整[19]。同樣數據也顯示，Solibacterales、黃色單胞菌目、亞硝化單胞菌目、纖線桿菌目、Subgroup 10則在低密度套種中變化不明顯，高密度時才發生顯著變化，細菌結構重新調整，逐步形成新的相對優勢群落，達到一個新的相對穩定狀態。

3.3 土壤細菌群落與土壤環境因子的關系

RDA結果顯示，土壤有機質、氮等養分含量變化對土壤細菌群落產生影響。Magill等對森林土壤的研究表明，酸桿菌門在土壤氮循環中起重要作用，土壤氮含量的增加會使酸桿菌門多樣性增加[29]，同樣板栗-掌葉覆盆子系統中酸桿菌門與土壤水解性氮相關性最大，酸桿菌目與土壤全氮含量、土壤水解性氮含量密切相關。同時模式間酸桿菌門相對豐度的變化和土壤氮含量的變化基本一致，這也與酸桿菌門可作為較貧瘠土壤環境指標的結論一致[30]。綠彎菌門是一類通過光合作用產生能量的兼性厭氧類細菌，其數量的變化可能同土壤中有機質增加有關[23]，同樣RDA結果也顯示綠彎菌門與土壤有機質含量相關性最大。