腦膠質瘤中Fbxw7蛋白的表達☆

楊卓 王新軍○☆ 付旭東 曾凡濤 王修成 周少龍 張旭陽

基礎領域針對膠質瘤分子標志物的研究，為膠質瘤分子學機制、靶向藥物的研制提供了至關重要的理論基礎。異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)[1]對膠質瘤的分級以及預后判斷有重要的意義。F框/WD-40域蛋白7（FBox and WD40 domain protein 7,Fbxw7）為一種重要的腫瘤抑制因子，參與細胞的增殖、分化、凋亡、癌變等過程[2]。既往有文獻報道其在膠質瘤組織中的應用價值[3]。針對上述兩種蛋白在膠質瘤組織中的潛在研究價值，我們通過免疫組織化學法，蛋白質印記法檢測膠質瘤組織中Fbxw7的表達與分布，并探討Fbxw7的表達與IDH1之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年1月1日至2015年12月31日于鄭州大學第五附屬醫院神經外科治療的86例膠質瘤患者的膠質瘤組織標本。納入標準：①由影像學、病理明確診斷為膠質瘤；②初次發病，首次手術切除；③術前未接受放療，化療及其他治療；④無其他神經系統疾患。排除標準：①術前發生腦疝、腫瘤卒中者；②術后隨訪期各種原因死亡者；③精神心理異常者。同時選取30例頭顱外傷去骨瓣內減壓患者腦組織作為對照組。膠質瘤WHOⅠ級10例，其中毛細胞型星形細胞瘤8例，室管膜下巨細胞型星形細胞瘤2例；Ⅱ級38例，Ⅲ級26例，其中少突膠質細胞瘤14例，間變性星形細胞瘤12例；Ⅳ級12例。對所有納入研究的患者進行為期36個月的隨訪。本研究已告知患者家屬并取得知情同意。兔多克隆抗體Fbxw7購于Abcam公司 （貨號ab109617），兔多克隆抗體IDH1、鼠/兔通用型S-P超敏試劑盒、二氨基聯苯胺（DAB）顯色液、NC膜購于北京索萊寶科技有限公司，熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 Fbxw7、IDH1分布檢測86例標本在離體后迅速經10%甲醛固定，常規石蠟包埋。標本做連續切片，置于防脫劑預處理后的載玻片上，滴加Fbxw7抗體4℃過夜，磷酸緩沖液（PBS）清洗后滴加生物素標記二抗，室溫孵育20min,PBS清洗加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15min，DAB顯色液顯色，沖洗，蘇木精復染等后于顯微鏡下觀察。選擇每張切片免疫反應較強的區域，高倍鏡視野（×400）觀察5個不重復視野，計數Fbxw7陽性細胞，IDH1蛋白免疫組化按照同樣類似方法進行。其中：陽性細胞百分比≤25%為1分，≤50%為2分，≤75%為3分，＞75%為 4分；根據染色程度評分：無染色者為0分，淡黃色者為1分，黃色或棕褐色者為2分，褐色者為3分。最后以兩者評分的總和為最終評分，0分為陰性，1～7分為陽性，其中1～3分為低表達，4～7分為高表達。

1.3 Fbxw7、IDH1蛋白印跡檢測用剪刀剪取少許新鮮冰凍組織并將其剪碎后置入1.5 mL EP管中，加RIPA裂解液至0.5 mL，充分溶解離心后提取上清。根據BCA顯色法，制作標準曲線，得出系數R2=0.995，估算出蛋白濃度。加入4×loading buffer，保證蛋白濃度5 mg/mL左右，煮沸后備用。配置12%分離膠，5%濃縮膠，按照電泳、轉NC膜、一抗孵育、過夜后二抗孵育、顯色、曝光，得出蛋白條帶。過程中嚴格按照操作程序進行。

1.4 統計學方法采用SPSS 21.0進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，免疫組化中腫瘤組織與對照組織，低病理級別（Ⅰ、Ⅱ級）與高病理級別（Ⅲ、Ⅳ級）組織中Fbxw7、IDH1的表達采用單因素χ2檢驗，蛋白印記中蛋白表達差異采用兩獨立樣本t檢驗；Fbxw7蛋白表達與臨床病理參數的關系采用單因素 χ2檢驗；Fbxw7與IDH1的表達相關性采用關聯系數r表示，檢驗水準均為 α=0.05。

2 結果

2.1 Fbxw7在腦組織中的表達Fbxw7蛋白在腫瘤組織中的表達主要在胞漿中，可見黃色或棕黃色的顆粒物質，其陽性表達率為83.72%，對照組中Fbxw7陽性表達率為46.67%，腫瘤組織中Fbxw7 的表達明顯高于對照組中（χ2=15.927，P＜0.01）；低病理級別腫瘤組織中Fbxw7蛋白的陽性表達率為93.75%，高病理級別組織中Fbxw7蛋白的陽性表達率為71.05%，低病理級別中Fbxw7蛋白陽性表達率明顯高于高病理級別組織，差異存在統計學意義（χ2=8.017，P＜0.01），見表 1，圖 1。

2.2 IDH1在腦組織中的表達IDH1在腫瘤組織胞核中呈現黃色或棕褐色的顆粒物質，少量見于胞漿和胞膜中，其在腫瘤組織中陽性率為86.06%，對照組中陽性率為66.67%，腫瘤組織中IDH1的表達明顯高于對照組中 （χ2=5.435，P=0.023）；低病理級別腫瘤組織中IDH1蛋白的陽性表達率為79.17%，高病理級別組織中IDH1蛋白的陽性表達率為94.73%，高病理級別中IDH1蛋白陽性表達率明顯高于低病理級別組織，差異存在統計學意義（χ2=4.282，P=0.036），見表 2，圖 2。

2.3 Fbxw7蛋白質印記應用Image Lab 5.2.1軟件，將實驗標本Fbxw7蛋白的光密度條帶與內參GAPDH蛋白條帶值進行相比，所得值代表Fbxw7蛋白表達水平，對照組0.73±0.11，腫瘤組2.75±0.83,低級別 3.22±0.51，高級別 1.86±0.53，膠質瘤組織中Fbxw7蛋白表達高于陰性對照組 （t=-13.251,P＜0.01），低病理級別中 Fbxw7蛋白表達水平較高病理級別組織明顯升高（t=10.445,P＜0.01）,見圖 3。

2.4 IDH1蛋白質印記同樣的方法，所得值代表IDH1蛋白表達水平，對照組0.27±0.07，腫瘤組0.68±0.20,低級別 0.47±0.12，高級別 0.80±0.13，膠質瘤組織中IDH1蛋白表達高于陰性對照組（t=-10.838,P＜0.01），高病理級別中 IDH1 蛋白表達水平較低病理級別組織明顯升高（t=-11.051,P＜0.01），見圖 3。

2.5 Fbxw7的表達與相關參數的關系腫瘤直徑、病理級別、癲癇發作情況、IDH1的表達影響Fbxw7的表達（P＜0.05），且 Fbxw7與 IDH1的表達相關性關聯系數r=0.51，而年齡，性別，頭暈病史、膠質瘤細胞成分，術前KPS評分、腫瘤部位與Fbxw7 的表達無關(P＞0.05)，見表 3。

3 討論

腫瘤研究已逐漸轉化至基因水平、信號傳導通路。既往我們研究了膠質瘤多個分子標志物[4]，對膠質瘤的基本生物學特征有了初步的了解。Fbxw7蛋白屬于F-box蛋白家族的一員，能特異性地識別和降解泛素-蛋白酶體系統（UPS）中的底物蛋白，在細胞周期調節、轉錄調節、凋亡和細胞信號轉導中具有重要作用，Fbxw7突變和缺失可導致染色體不穩定，加速癌細胞增殖相關基因的積累，如myc、cycline等[5]。最近的研究表明，Fbxw7被認為是一種針對各種致癌蛋白的腫瘤抑制因子，Fbxw7基因突變和缺失能引起這些與癌細胞增殖相關基因的積累，且已經在卵巢癌、乳腺癌、結直腸癌和膠質瘤中被發現[6-7]。

圖1 膠質瘤組織和對照組織中Fbxw7的表達（×400）。A：對照組織中Fbxw7的染色;B：膠質瘤WHOⅠ級中Fbxw7的染色;C：膠質瘤WHOⅡ級中Fbxw7的染色;D：膠質瘤WHOⅢ級中Fbxw7的染色;E：膠質瘤WHOⅣ級中Fbxw7的染色

圖2 膠質瘤組織和對照組織中IDH1的表達（×400）。A：對照組織中IDH1的染色;B：膠質瘤WHOⅠ級中IDH1的染色;C：膠質瘤WHOⅡ級中IDH1的染色;D：膠質瘤WHOⅢ級中IDH1的染色;E：膠質瘤WHOⅣ級中IDH1的染色

圖3 蛋白印跡法檢測腦組織中Fbxw7、IDH1蛋白的表達水平。1：對照組織；2：膠質瘤組織；3：低病理級別膠質瘤組織；4：高病理級別膠質瘤組織；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表1 Fbxw7在不同組織中的表達差異

表2 IDH1在不同組織中的表達差異

本研究表明，Marker標記Fbxw7的分子量約70kDa，在膠質瘤組織中，低級別中陽性率明顯高于高級別陽性率，既往學者研究表明，在膠質母細胞瘤中，Fbxw7的表達顯著降低，且可作為膠質母細胞瘤患者的生存標志[3]，另有學者研究乳腺癌時稱Fbxw7蛋白在乳腺癌組織和細胞系中表達水平下降[8]。上述結論與我們的研究結果基本符合，我們的猜測是：Fbxw7作為各種致癌蛋白的抑制因子，在低級別膠質瘤中尚可發揮其抑制作用，表現出較高的陽性表達，然而在高級別膠質瘤中，腫瘤高復雜性致使Fbxw7蛋白的功能受到更大程度的限制，其抑制能力顯著下降，表現為陽性表達逐漸下降，具體原因還需進一步實驗驗證。既往對IDH1蛋白的研究已經相當深入，目前IDH1已被WHO作為膠質瘤的分級指標[9]，本研究中Marker標記IDH1的分子量約45kDa,IDH1蛋白在膠質瘤組織中明顯表達，且隨著膠質瘤級別的升高而表達升高（P＜0.05），有文獻稱IDH1的不同程度表達與膠質瘤惡性程度存在一定的相關性，且未處理的低級別膠質瘤，極易轉變為膠質母細胞瘤[10]，因此IDH1用來研究膠質瘤的生物學特征，將有重要意義。本研究結果顯示Fbxw7蛋白的表達與IDH1 存在相關性（P＜0.05，r=0.51），且兩者在不同膠質瘤級別的表達呈相反趨勢，是否存在相關上下游通路或拮抗關系尚不清楚。

表3 Fbxw7的表達與臨床病理參數分析（例）

腫瘤直徑直接反應腫瘤體積大小，Fbxw7蛋白與腫瘤直徑相關，可能是隨著腫瘤體積的增大，Fbxw7蛋白功能受到影響所致。本研究顯示低級別腫瘤組織中Fbxw7蛋白的陽性率高于高病理級別陽性率，此結論于其他文獻也有類似報道[3]，可能是Fbxw7的生物功能受到更多的抑制，從而在高級別膠質瘤中表達下降，提高腫瘤復雜程度，增加治療難度，有研究顯示：Mir-223/Fbxw7通路是許多人類癌癥（如胃癌、乳腺癌和非小細胞肺癌）耐藥機制的重要線索[11]。因此，從Fbxw7入手，解決高級別膠質瘤復發率，提高化療藥物控制率，可能是潛在的突破口。癲癇的發生對于膠質瘤本身而言，提高了膠質瘤的檢出率，既往我們課題組已經明確多個腫瘤標志物與癲癇發作存在相關性[12]，本研究顯示Fbxw7與膠質瘤中癲癇存在相關性，文獻報道癲癇多發生于低級別膠質瘤中[13]，且與我們本研究得出的結論：Fbxw7在低級別膠質瘤陽性率升高相吻合，至于具體機制，還需相關實驗來驗證。另外，隨著對膠質瘤研究的逐步深入，針對特定膠質瘤病理類型的研究，為個體化的單一治療顯的尤為重要，本研究限于標本數量，結果顯示Fbxw7與少突膠質瘤并無相關性，可能是Fbxw7在少突膠質瘤中并無特異性，此方面結論還需在擴大樣本量的基礎上做多中心、多角度的探索。

總之，本研究通過對Fbxw7、IDH1蛋白在膠質瘤組織中的表達情況及其之間的關系，對膠質瘤的機制有了新的認識，從診斷角度來說，Fbxw7蛋白有望用來反映膠質瘤的生物特征，然而Fbxw7蛋白通過何種途徑改變膠質瘤的侵襲生長機制，Fbxw7蛋白的不同表達對膠質瘤患者的預后影響如何，將是我們下一步工作的重點。