兒童馬方綜合征患者原纖維蛋白1基因突變與臨床表型的相關(guān)性研究

孔 煜 李 揚(yáng) 李玉琳 張曉平 鄭 萍 溫海初 杜 杰

馬方綜合征（Marfan syndrome，MFS）是嚴(yán)重遺傳性結(jié)締組織病，為常染色體顯性遺傳，發(fā)病率在1/3 000～5 000[1-2]，MFS臨床表現(xiàn)不一，主要累及眼睛、骨骼、心血管等器官組織。骨骼系統(tǒng)的主要表現(xiàn)包括身材高大，胸廓畸形，蜘蛛指，脊柱側(cè)凸等；眼睛主要表現(xiàn)在高度近視和晶狀體異位；心血管系統(tǒng)主要表現(xiàn)在主動(dòng)脈根部的擴(kuò)張以及伴隨的主動(dòng)脈瘤和主動(dòng)脈夾層，其他還包括二尖瓣和三尖瓣的脫垂以及鄰近肺動(dòng)脈的擴(kuò)張，是MFS患者就醫(yī)和死亡的主要原因[3]。目前，MFS的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)2010年發(fā)布的修訂版Ghent標(biāo)準(zhǔn)[4]。

MFS主要由編碼原纖維蛋白1的（fibrillin 1，F(xiàn)BN1）基因突變引起[5]，F(xiàn)BN1基因位于人類第15號(hào)染色體，有65個(gè)外顯子，迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)3 000種FBN1基因的突變[6]，每個(gè)家庭的突變幾乎都是獨(dú)特的，突變方式包括無(wú)義、移碼、剪接、插入/缺失以及錯(cuò)義突變[7]，也包括整個(gè)基因和多個(gè)外顯子的丟失[2]。

基因型和臨床表型的復(fù)雜多變[8]，對(duì)MFS的臨床決策造成了極大的困難。目前，國(guó)人對(duì)MFS基因型和表型研究十分有限，基因型和表型的關(guān)聯(lián)尚不清楚，本研究試圖分析我院兒童MFS患者FBN1基因的突變譜，尋找FBN1基因新的致病位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)基因型與臨床表型之間的關(guān)聯(lián)，為國(guó)人中兒童MFS患者的臨床診療提供理論基礎(chǔ)。

資料與方法

1.研究對(duì)象 本研究納入了2014年至2016年間，就診于北京安貞醫(yī)院的30例臨床確診或疑似MFS的兒童患者（年齡＜18周歲），診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2010修訂版Ghent標(biāo)準(zhǔn)[4]。所有的兒童患者都經(jīng)過(guò)專業(yè)醫(yī)師的評(píng)估并且有詳細(xì)的臨床信息。本研究通過(guò)了北京安貞醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查，所有患者均簽署了知情同意書(shū)。所有患者都是漢族人。

2.血液樣本獲取及DNA提取 取兒童MFS患者外周靜脈血2 mL（EDTA抗凝），用QIAamp全血DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit）提取基因組DNA。

3.Ion AmpliSeq NGS Panel目標(biāo)測(cè)序 應(yīng)用Ion AmpliSeq NGSPanel靶向目標(biāo)測(cè)序技術(shù)（賽默飛），對(duì)FBN1基因目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行NGS測(cè)序。針對(duì)FBN1基因用AmpliSeq Panel擴(kuò)增目的片段，進(jìn)行磁珠純化、鏈霉素標(biāo)記測(cè)序。將100 pmol文庫(kù)與磁珠結(jié)合在油包水?dāng)U增后，鏈霉素標(biāo)記目的基因，進(jìn)行Ion PGM上機(jī)測(cè)序。

4.生物信息學(xué)分析 （1）原始數(shù)據(jù)的處理：①處理原始數(shù)據(jù)生成BAM文件（軟件：Torrent Suite）；②BAM文件分類、索引、再分類去除錯(cuò)誤的SNP（軟件：Genome Analysis Tool Kit、Samtools）。

（2）信息注釋以及過(guò)濾篩選：1）信息注釋包括：基因參考序列、染色體和cDNA位置、氨基酸變化以及相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫(kù)信息。（軟件：ANNOVAR；數(shù)據(jù)庫(kù)：SNP數(shù)據(jù)庫(kù)（dbSNP142），千人基因組，外顯子測(cè)序計(jì)劃（ESP6500），人類外顯子數(shù)據(jù)庫(kù)（ExAC03），全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（cg60），人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD），以及眾多的功能預(yù)測(cè)軟件）；2）過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)：①在千人基因組，外顯子測(cè)序計(jì)劃（ESP6500），人類外顯子數(shù)據(jù)庫(kù)（ExAC03）中最小等位基因頻率（MAF）＜0.1%；②破壞性突變包括：移碼突變、插入或缺失、終止突變、剪接突變；③非同義突變：a.M-CAP score＞0.025；b.REVEL score＞0.5；c.6項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中至少符合5項(xiàng)：SIFT＜0.1，Polyphen2＞0.9，CADD score＞30，GERP＞5，Mutation-Taster=“A”or“D”，and LRT=“D”。

（3）篩選結(jié)果分為兩類：已知致病突變和疑似致病突變。

（4）計(jì)算患者主動(dòng)脈根部Z評(píng)分：Z評(píng)分是一個(gè)用來(lái)標(biāo)化數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法，計(jì)算公式是主動(dòng)脈根徑實(shí)測(cè)值與平均值的差值（單位為mm）再除以標(biāo)準(zhǔn)差，評(píng)分越高代表患者主動(dòng)脈擴(kuò)展程度越高。

5.Sanger sequencing驗(yàn)證 對(duì)篩選出的突變合成對(duì)應(yīng)的DNA引物，用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，用ABI 3730xl測(cè)序儀（美 國(guó)Applied Biosystems公司）以Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與靶向目標(biāo)測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS軟件完成。應(yīng)用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)來(lái)確定數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。符合條件的分類變量以頻數(shù)（率）表示，使用χ2檢驗(yàn)或使用Fisher精確概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.我們對(duì)30例兒童先證者進(jìn)行了基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)27例兒童患者攜帶致病或者疑似致病的FBN1突變，其中錯(cuò)義突變19例，截短突變8例，剪接突變3例（表1）。

2.用主動(dòng)脈Z評(píng)分對(duì)兒童MFS患者的主動(dòng)脈直徑量化結(jié)果 在主動(dòng)脈Z評(píng)分≥3的患者中，大部分患者攜帶截短或者剪接突變（70.0%），小部分患者攜帶錯(cuò)義突變（30.0%），在主動(dòng)脈Z評(píng)分＜3的患者中，大部分患者攜帶錯(cuò)義突變（76.5%），小部分患者攜帶截短或者剪接突變（23.5%）。和主動(dòng)脈Z評(píng)分＜3的兒童患者相比，主動(dòng)脈Z評(píng)分≥3的兒童患者有更多的患者攜帶截短或者剪接突變（70.0%vs.23.5%，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故攜帶截短或者剪接突變的兒童患者主動(dòng)脈擴(kuò)張的程度更高（表2）。

表1 27例患者FBN1基因突變類型測(cè)序結(jié)果

表2 27例患者的主動(dòng)脈Z評(píng)分組間FBN1基因突變類型分布[n（%）]

3.FBN1基因中半胱氨酸相關(guān)基因突變與臨床表型關(guān)系[9]本研究發(fā)現(xiàn)16例攜帶FBN1錯(cuò)義突變的患者中，按照突變是否和半胱氨酸相關(guān)將患者分為兩個(gè)亞組，其中一組有8例攜帶半胱氨酸相關(guān)FBN1突變，另一組有8例攜帶非半胱氨酸相關(guān)FBN1突變，攜帶半胱氨酸相關(guān)突變的兒童患者有更容易出現(xiàn)晶狀體異位的趨勢(shì)（P=0.119，表3）。

表3 半胱氨酸相關(guān)FBN1基因突變與晶狀體異位

討論

自Dietz等[5]第一次發(fā)現(xiàn)FBN1基因突變導(dǎo)致MFS已經(jīng)有20余年，F(xiàn)BN1基因編碼的原纖維蛋白1是一種糖蛋白，廣泛的分布在細(xì)胞外基質(zhì)中，對(duì)彈性纖維的形成至關(guān)重要，F(xiàn)BN1基因的突變會(huì)引起原纖維蛋白1的異常，從而引起MFS的一系列表型。人們對(duì)這其中的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。有研究認(rèn)為，F(xiàn)BN1基因突變引起MFS的機(jī)制可以用單倍劑量不足和顯性負(fù)效應(yīng)兩種機(jī)制來(lái)解釋，單倍劑量不足指一個(gè)等位基因突變后，另一個(gè)等位基因能正常表達(dá)，但這只有正常水平50%的蛋白質(zhì)不足以維持細(xì)胞正常的生理功能；顯性負(fù)效應(yīng)指某些蛋白突變后不僅自身無(wú)功能，還能抑制或阻斷其他蛋白的作用[3]。近來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)，MFS和TGP-β信號(hào)通路的異常有關(guān)[10-12]，在MFS患者中，F(xiàn)BN1基因的突變導(dǎo)致TGP-β配體的釋放失控，上調(diào)經(jīng)典和非經(jīng)典TGP-β信號(hào)通路，從而導(dǎo)致TGP-β靶基因的過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致原纖維蛋白的異常，引發(fā)MFS的臨床表型。

人們也對(duì)MFS基因型和臨床表型的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了大量的研究，但是只獲得了為數(shù)不多的發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)FBN1基因發(fā)生半胱氨酸替換與晶狀體異位有關(guān)[9]；攜帶截短或者剪接突變的MFS患者更易發(fā)生主動(dòng)脈事件[13]；FBN1單倍劑量不足突變的患者更多地出現(xiàn)了雞胸、硬腦膜擴(kuò)張、皮紋等表現(xiàn)[14]，并且這些患者有更高的風(fēng)險(xiǎn)出現(xiàn)主動(dòng)脈事件和心血管相關(guān)的死亡[15]；FBN1基因第47號(hào)外顯子跳躍突變的MFS患者更容易發(fā)生主動(dòng)脈相關(guān)疾病[16]；FBN1基因24-32號(hào)外顯子的突變和新生兒MFS或者嚴(yán)重的MFS表型相關(guān)[17]。

本研究是中國(guó)人群中少有的有關(guān)兒童MFS患者的研究，我們發(fā)現(xiàn)在中國(guó)人群中攜帶截短或剪接突變的兒童MFS患者主動(dòng)脈擴(kuò)張的程度更高，相比之下攜帶錯(cuò)義突變的兒童MFS患者主動(dòng)脈擴(kuò)張程度較小，這一發(fā)現(xiàn)和Baudhuin等[13]的發(fā)現(xiàn)，在某種層面上是一致的，他們的結(jié)果提示攜帶截短或剪接突變的患者更易出現(xiàn)主動(dòng)脈事件（主動(dòng)脈瘤和主動(dòng)脈夾層）。

本研究也存在局限性，首先，北京安貞醫(yī)院是中國(guó)最大的MFS診療中心之一，這些兒童患者可能都有比較嚴(yán)重的表型；其次，患者人數(shù)相對(duì)較少，數(shù)據(jù)可能有所偏倚；再者，很多新報(bào)道的突變的判定都是基于生物信息學(xué)的分析和相關(guān)軟件的預(yù)測(cè)，缺少對(duì)應(yīng)的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)；在以后的研究中，我們會(huì)做出相應(yīng)的改進(jìn)。

總之，主動(dòng)脈相關(guān)的表型仍然是MFS患者最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶截短或剪接突變的兒童MFS患者主動(dòng)脈擴(kuò)張的程度更高，這對(duì)兒童MFS患者的未來(lái)臨床診療具有重要的意義。