細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子單克隆抗體抑制ApoE（-/-）小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的實(shí)驗(yàn)研究

姚益群 吳勇 申松波 楊浩

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）是動(dòng)脈硬化血管病中最常見、最重要的一種，是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要原因[1-2]。As的特點(diǎn)是其所受累動(dòng)脈的病變開始于內(nèi)膜，先后合并有多種病變，包括局部脂質(zhì)及復(fù)合糖類積聚、纖維組織增生以及鈣質(zhì)沉著而導(dǎo)致斑塊形成，并漸發(fā)生動(dòng)脈中層退變，其繼發(fā)性病變尚有斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂以及局部血栓形成。病變常常累及大、中肌性動(dòng)脈，一旦發(fā)展到其體積足以阻塞動(dòng)脈管腔，則會(huì)導(dǎo)致該所受累動(dòng)脈所供應(yīng)的組織或者器官的缺血或壞死[3-4]。在As發(fā)生及發(fā)展過程中，有著多種危險(xiǎn)因素的參與，然而在這諸多危險(xiǎn)因素中，高脂血癥占首要地位。血脂中的TG，LDL-C水平是判斷As的最佳標(biāo)志[5]。目前針對(duì)As所導(dǎo)致的心腦血管疾病的抑制與治療尚未找到有效預(yù)防及治療手段，現(xiàn)急需尋找一種安全有效，無不良反應(yīng)并具有良好的社會(huì)學(xué)效益，且能有效緩解As患者體內(nèi)血脂代謝紊亂，降低As等血管并發(fā)癥發(fā)病率的新型藥物，具有重要的臨床意義。

細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer EMMPRIN），屬于免疫球蛋白超家族成員之一，多見于腫瘤細(xì)胞表面，可使腫瘤細(xì)胞遷移、浸潤[6]。有研究表明，EMMPRIN在As斑塊內(nèi)表達(dá)較高，并參與了As病變的發(fā)展[7]。進(jìn)來的研究表明，EMMPRIN參與As斑塊的破裂[8]。本研究構(gòu)建ApoE（-/-）小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，探究EMMPRIN對(duì)ApoE（-/-）小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用，為臨床上動(dòng)脈粥樣硬化治療提供思路與方法。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡，ApoE基因缺失（ApoE（-/-））雄性，小鼠30只（體質(zhì)量25～33 g），由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。6～8周齡雄性，C57BL/6 J小鼠10只（體質(zhì)量46～59 g），由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

2.方法 （1）建立AS模型：本實(shí)驗(yàn)采用8周齡，SPF級(jí)雄性，C57BL/6 J小鼠10只和ApoE（-/-）小鼠30只，體質(zhì)量（25±3）g，購于北京華阜康生物科技服份有限公司，批號(hào)11401300014365。置于室溫為（22±2）℃，濕度為（60±5）%，自然光照條件下，自由取食飲水。飼以高脂飼料（含21%脂肪和0.15%膽固醇），誘導(dǎo)構(gòu)建As動(dòng)物模型，模型成功率80%。

（2）實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法：將小鼠置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，隨機(jī)分為四組，每籠4～5只小鼠，具體分組情況如下：?：空白對(duì)照組：雄性C57BL/6 J小鼠10只，普通飼料喂養(yǎng)。?：ApoE（-/-）陰性對(duì)照組：ApoE（-/-）小鼠10只，普通飼料喂養(yǎng)。?：ApoE（-/-）陰性AS組：ApoE（-/-）小鼠10只，高脂飼料喂養(yǎng)。?：EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組：ApoE（-/-）小鼠10只，高脂飼料喂養(yǎng)，在高脂喂養(yǎng)12周成功誘導(dǎo)出小鼠As后給予100ug EMMPRIN單克隆抗體腹腔注射。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每周2次于08:00～10:00時(shí)按上述濃度給藥處理，連續(xù)給藥8周。

（3）標(biāo)本采集：一般指標(biāo)：給藥期間觀察并記錄各組小鼠的體質(zhì)量、攝食量、外觀體征、行為活動(dòng)、毛發(fā)狀態(tài)，精神狀態(tài)和死亡情況。

（4）血液標(biāo)本采集：治療結(jié)束第2天，10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，經(jīng)心臟取血1～2 mL，生化采血管收集。靜置3 h，4 000rpm離心取血清，4℃保存。

（5）組織標(biāo)本采集：取血后，每組取10只，摘取小鼠主動(dòng)脈組織，液氮速凍后，-80℃保存，留待后續(xù)實(shí)驗(yàn)備用。其余小鼠，摘取主動(dòng)脈后置于4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液中固定保存。

（6）冷凍切片的制備：取4%多聚甲醛固定的組織，依次置于20%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液，4℃靜置梯度脫水。脫水完全的組織，采用OCT包埋劑包埋，置于液氮快速冷凍，冷凍切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為10μm，自然晾干后4℃保存。

3.檢測指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)方法 （1）血清生化指標(biāo)檢測：采用全自動(dòng)生化分析儀（CX-7，Beckman）分析下列血液生化指標(biāo)：TC、TG、氧化低密度脂蛋白、LDIC、HDL-C，載脂蛋白A、B和E，并計(jì)算血脂As指數(shù)和體脂含量。

（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測：摘取小鼠主動(dòng)脈組織加入1 mL的Trizol RNA iso（Takara，日本），經(jīng)研磨棒充分研磨后，提取總RNA，檢測總RNA的純度，在1.9～2.0的范圍，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA，4℃保存，采用20μL反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR檢測。采用FS 2000系統(tǒng)進(jìn)行分析，反應(yīng)條件為：95℃30 s。PCR：95℃5s；60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線：95℃5s；60℃1min。降溫：50℃30 s，1個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因GAPDH、FGP-2和VEGF的引物由上海生工公司設(shè)計(jì)（表1）。采用2-△△CT的方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因的引物序列

（3）Western-blot檢測：摘取小鼠主動(dòng)脈組織1 mg，加入1 mL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，收集入1.5 mL離心管，在4℃離心機(jī)中離心，預(yù)設(shè)：5 000 r/min，5 min后提取上清，后95℃煮沸，4℃保存。按照說明書制備濃縮膠10 mL，分離膠20 mL。上樣后電泳分離，轉(zhuǎn)膜，F(xiàn)GP-2和VEGF的一抗經(jīng)一抗稀釋液1:10 000稀釋后加入樣本離子膜，4℃冰箱避光孵育過夜（＞12 h），PBST洗膜，5 min，重復(fù)3次，用山羊抗小鼠IgG二抗經(jīng)稀釋液1:1 000稀釋后孵育1.5 h，PBST洗膜5 min，重復(fù)3次，用DAB顯影液處理樣本。Image J軟件分析蛋白條帶。

（4）免疫組化染色：按照中杉金橋超敏二步法試劑盒的說明書對(duì)冷凍切片進(jìn)行操作。加入一抗（VEGF）4℃孵育過夜，TBS漂洗后加入鏈霉親和生物素辣根酶（SABC）標(biāo)記二抗，37℃孵育20 min，DAB顯色，陽性細(xì)胞呈棕黃色。光學(xué)顯微下觀察，每張切片隨機(jī)取五個(gè)視野，對(duì)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其均值。以陽性細(xì)胞指數(shù)（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）表示蛋白表達(dá)水平。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件19.0版本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，四組的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK法檢測。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.各組血清生化指標(biāo)的檢測結(jié)果 在血清學(xué)生化指標(biāo)中的TG、TC、HDL-C、LDL-C的比較中，ApoE（-/-）AS模型組與ApoE（-/-）陰性對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組與ApoE（-/-）AS模型組的比較中，在TG、TC、LDL-C等指標(biāo)中，EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組明顯低于ApoE（-/-）AS模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組的HDL-C均高于AS模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在生化指標(biāo)中的載脂蛋白A1和載脂蛋白B的比較中，ApoE（-/-）AS模型組與ApoE（-/-）陰性對(duì)照組相比，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組與ApoE（-/-）AS模型組相比，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：AS模型組中VEGF蛋白表達(dá)量明顯大于空白對(duì)照組（P＜0.05）；陰性對(duì)照組中主動(dòng)脈VEGF蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組中主動(dòng)脈VEGF蛋白表達(dá)量明顯降低，與AS模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較（，n=40）

表1 各組血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較（，n=40）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與ApoE（-/-）AS模型組比較，#P＜0.05

項(xiàng)目 空白對(duì)照組 EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組ApoE（-/-）AS模型組ApoE（-/-）陰性對(duì)照組例數(shù) 10 10 10 10 TG 2.532±0.784 1.613±0.323# 2.324±1.014* 1.796±0.944#TC 3.865±1.315 22.867±5.314*23.461±9.667* 10.666±6.114#HDL 1.256±0.174 4.027±1.645*#3.184±0.949*#2.324±0.951#LDL 0.584±0.124 6.119±2.894* 6.273±2.119* 3.929±0.917#ApoA1 0.010±0.007 0.007±0.001 0.008±0.005 0.001±0.004 ApoB 0.028±0.014 0.028±0.009 0.022±0.017 0.054±0.037

3.各組免疫組織化學(xué)分析結(jié)果 免疫組化顯示，棕黃色陽性顆粒主要表達(dá)在模型小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。空白對(duì)照組均未見明顯的VEGF蛋白的表達(dá)。ApoE（-/-）AS模型組中VEGF蛋白表達(dá)量明顯大于空白對(duì)照組（P＜0.05）；ApoE（-/-）陰性對(duì)照組中主動(dòng)脈VEGF蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組中主動(dòng)脈VEGF蛋白表達(dá)量明顯降低，與As模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 FGP-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量 圖2 VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量 圖3 FGP-2和VEGF蛋白的表達(dá)量 A：空白對(duì)照組，B：ApoE（-/-）陰性AS組，C：ApoE（-/-）陰性對(duì)照組，D：EMMPRIN單克隆抗體干預(yù)組

圖2 免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果（400X）

討論

動(dòng)脈粥樣硬化是個(gè)逐漸變化的過程，始于內(nèi)皮細(xì)胞的病變，然后伴隨脂質(zhì)沉積、炎癥細(xì)胞浸潤等密切相關(guān)[9-11]。本文就EMMPRIN單克隆抗體對(duì)于As的作用機(jī)制，以及探討是否作用于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制[12-15]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇100μg EMMPRIN單克隆抗體腹腔注射給藥。

TG、TC、HDL-C、LDL-C，是導(dǎo)致As和各種心腦血管疾病的首要因素[16]。最近研究認(rèn)為，LDL-C是唯一能將膽固醇帶入血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的脂蛋白，是促進(jìn)As斑塊形成的關(guān)鍵物質(zhì)。本研究通過檢測TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量來驗(yàn)證造模的成功與否，結(jié)果顯示，ApoE（-/-）AS組與ApoE（-/-）陰性對(duì)照組相比，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證明了實(shí)驗(yàn)As模型構(gòu)建成功。另外，本研究還以TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量變化來檢測EMMPRIN單克隆抗體對(duì)As的治療作用，結(jié)果顯示EMMPRIN單克隆抗體治療組中TG、TC、LDL-C等明顯低于ApoE（-/-）AS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明EMMPRIN單克隆抗體對(duì)As的發(fā)展進(jìn)程具有明顯的抑制與治療作用。EMMPRIN單克隆抗體治療組的HDL-C均高于AS模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明EMMPRIN單克隆抗體對(duì)于以HDL-C升高為主的高脂血癥與As同樣具有一定的抑制與治療作用。ApoE（-/-）AS組與ApoE（-/-）陰性對(duì)照組生化指標(biāo)中的載脂蛋白A1和載脂蛋白B的比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步說明了本實(shí)驗(yàn)As的構(gòu)建成功。而EMMPRIN單克隆抗體對(duì)于As具有明顯的抑制作用。

為探究EMMPRIN單克隆抗體在As的機(jī)制中是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[17]相關(guān)，本研究采用RT-PCR、Western-Blot和免疫組化等半定量的實(shí)驗(yàn)方法，比較內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白VEGF蛋白[18]和FGP-2蛋白[19]以上四組細(xì)胞中的表達(dá)量。空白對(duì)照組均未見明顯的VEGF蛋白和FGP-2蛋白的表達(dá)。EMMPRIN單克隆抗體治療組中主動(dòng)脈VEGF蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明EMMPRIN單克隆抗體可以抑制VEGF蛋白的表達(dá)，從而證明EMMPRIN單克隆抗體可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白VEGF和FGP-2蛋白作用于動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞，從而抑制As。

綜上所述，EMMPRIN單克隆抗體通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激VEGF蛋白和FGP-2蛋白的表達(dá)發(fā)揮其抑制As的作用。