細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子單克隆抗體抑制ApoE（-/-）小鼠動脈粥樣硬化形成的實驗研究

姚益群 吳勇 申松波 楊浩

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）是動脈硬化血管病中最常見、最重要的一種，是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要原因[1-2]。As的特點是其所受累動脈的病變開始于內膜，先后合并有多種病變，包括局部脂質及復合糖類積聚、纖維組織增生以及鈣質沉著而導致斑塊形成，并漸發生動脈中層退變，其繼發性病變尚有斑塊內出血、斑塊破裂以及局部血栓形成。病變常常累及大、中肌性動脈，一旦發展到其體積足以阻塞動脈管腔，則會導致該所受累動脈所供應的組織或者器官的缺血或壞死[3-4]。在As發生及發展過程中，有著多種危險因素的參與，然而在這諸多危險因素中，高脂血癥占首要地位。血脂中的TG，LDL-C水平是判斷As的最佳標志[5]。目前針對As所導致的心腦血管疾病的抑制與治療尚未找到有效預防及治療手段，現急需尋找一種安全有效，無不良反應并具有良好的社會學效益，且能有效緩解As患者體內血脂代謝紊亂，降低As等血管并發癥發病率的新型藥物，具有重要的臨床意義。

細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer EMMPRIN），屬于免疫球蛋白超家族成員之一，多見于腫瘤細胞表面，可使腫瘤細胞遷移、浸潤[6]。有研究表明，EMMPRIN在As斑塊內表達較高，并參與了As病變的發展[7]。進來的研究表明，EMMPRIN參與As斑塊的破裂[8]。本研究構建ApoE（-/-）小鼠動脈粥樣硬化模型，探究EMMPRIN對ApoE（-/-）小鼠動脈粥樣硬化的作用，為臨床上動脈粥樣硬化治療提供思路與方法。

材料與方法

1.實驗動物 6～8周齡，ApoE基因缺失（ApoE（-/-））雄性，小鼠30只（體質量25～33 g），由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。6～8周齡雄性，C57BL/6 J小鼠10只（體質量46～59 g），由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

2.方法 （1）建立AS模型：本實驗采用8周齡，SPF級雄性，C57BL/6 J小鼠10只和ApoE（-/-）小鼠30只，體質量（25±3）g，購于北京華阜康生物科技服份有限公司，批號11401300014365。置于室溫為（22±2）℃，濕度為（60±5）%，自然光照條件下，自由取食飲水。飼以高脂飼料（含21%脂肪和0.15%膽固醇），誘導構建As動物模型，模型成功率80%。

（2）實驗分組及給藥方法：將小鼠置于實驗動物標準條件下飼養，隨機分為四組，每籠4～5只小鼠，具體分組情況如下：?：空白對照組：雄性C57BL/6 J小鼠10只，普通飼料喂養。?：ApoE（-/-）陰性對照組：ApoE（-/-）小鼠10只，普通飼料喂養。?：ApoE（-/-）陰性AS組：ApoE（-/-）小鼠10只，高脂飼料喂養。?：EMMPRIN單克隆抗體干預組：ApoE（-/-）小鼠10只，高脂飼料喂養，在高脂喂養12周成功誘導出小鼠As后給予100ug EMMPRIN單克隆抗體腹腔注射。所有小鼠適應性喂養1周后，每周2次于08:00～10:00時按上述濃度給藥處理，連續給藥8周。

（3）標本采集：一般指標：給藥期間觀察并記錄各組小鼠的體質量、攝食量、外觀體征、行為活動、毛發狀態，精神狀態和死亡情況。

（4）血液標本采集：治療結束第2天，10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，經心臟取血1～2 mL，生化采血管收集。靜置3 h，4 000rpm離心取血清，4℃保存。

（5）組織標本采集：取血后，每組取10只，摘取小鼠主動脈組織，液氮速凍后，-80℃保存，留待后續實驗備用。其余小鼠，摘取主動脈后置于4℃預冷的4%多聚甲醛溶液中固定保存。

（6）冷凍切片的制備：取4%多聚甲醛固定的組織，依次置于20%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液，4℃靜置梯度脫水。脫水完全的組織，采用OCT包埋劑包埋，置于液氮快速冷凍，冷凍切片機連續切片，厚度為10μm，自然晾干后4℃保存。

3.檢測指標和實驗方法 （1）血清生化指標檢測：采用全自動生化分析儀（CX-7，Beckman）分析下列血液生化指標：TC、TG、氧化低密度脂蛋白、LDIC、HDL-C，載脂蛋白A、B和E，并計算血脂As指數和體脂含量。

（2）實時熒光定量PCR檢測：摘取小鼠主動脈組織加入1 mL的Trizol RNA iso（Takara，日本），經研磨棒充分研磨后，提取總RNA，檢測總RNA的純度，在1.9～2.0的范圍，利用逆轉錄試劑盒進行反轉錄cDNA，4℃保存，采用20μL反應體系進行熒光定量PCR檢測。采用FS 2000系統進行分析，反應條件為：95℃30 s。PCR：95℃5s；60℃30 s，40個循環。溶解曲線：95℃5s；60℃1min。降溫：50℃30 s，1個循環。內參基因GAPDH、FGP-2和VEGF的引物由上海生工公司設計（表1）。采用2-△△CT的方法計算相對表達量。

表1 目的基因的引物序列

（3）Western-blot檢測：摘取小鼠主動脈組織1 mg，加入1 mL RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，收集入1.5 mL離心管，在4℃離心機中離心，預設：5 000 r/min，5 min后提取上清，后95℃煮沸，4℃保存。按照說明書制備濃縮膠10 mL，分離膠20 mL。上樣后電泳分離，轉膜，FGP-2和VEGF的一抗經一抗稀釋液1:10 000稀釋后加入樣本離子膜，4℃冰箱避光孵育過夜（＞12 h），PBST洗膜，5 min，重復3次，用山羊抗小鼠IgG二抗經稀釋液1:1 000稀釋后孵育1.5 h，PBST洗膜5 min，重復3次，用DAB顯影液處理樣本。Image J軟件分析蛋白條帶。

（4）免疫組化染色：按照中杉金橋超敏二步法試劑盒的說明書對冷凍切片進行操作。加入一抗（VEGF）4℃孵育過夜，TBS漂洗后加入鏈霉親和生物素辣根酶（SABC）標記二抗，37℃孵育20 min，DAB顯色，陽性細胞呈棕黃色。光學顯微下觀察，每張切片隨機取五個視野，對陽性細胞計數，取其均值。以陽性細胞指數（陽性細胞數/細胞總數）表示蛋白表達水平。

4.統計學方法 應用SPSS統計軟件19.0版本進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，四組的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK法檢測。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.各組血清生化指標的檢測結果 在血清學生化指標中的TG、TC、HDL-C、LDL-C的比較中，ApoE（-/-）AS模型組與ApoE（-/-）陰性對照組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。EMMPRIN單克隆抗體干預組與ApoE（-/-）AS模型組的比較中，在TG、TC、LDL-C等指標中，EMMPRIN單克隆抗體干預組明顯低于ApoE（-/-）AS模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。EMMPRIN單克隆抗體干預組的HDL-C均高于AS模型對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。在生化指標中的載脂蛋白A1和載脂蛋白B的比較中，ApoE（-/-）AS模型組與ApoE（-/-）陰性對照組相比，均差異有統計學意義（P＜0.05）。EMMPRIN單克隆抗體干預組與ApoE（-/-）AS模型組相比，均差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.RT-PCR和Western blot檢測結果 RT-PCR和Western blot結果顯示：AS模型組中VEGF蛋白表達量明顯大于空白對照組（P＜0.05）；陰性對照組中主動脈VEGF蛋白表達量與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；EMMPRIN單克隆抗體干預組中主動脈VEGF蛋白表達量明顯降低，與AS模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組血清生化指標檢測結果比較（，n=40）

表1 各組血清生化指標檢測結果比較（，n=40）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與ApoE（-/-）AS模型組比較，#P＜0.05

項目 空白對照組 EMMPRIN單克隆抗體干預組ApoE（-/-）AS模型組ApoE（-/-）陰性對照組例數 10 10 10 10 TG 2.532±0.784 1.613±0.323# 2.324±1.014* 1.796±0.944#TC 3.865±1.315 22.867±5.314*23.461±9.667* 10.666±6.114#HDL 1.256±0.174 4.027±1.645*#3.184±0.949*#2.324±0.951#LDL 0.584±0.124 6.119±2.894* 6.273±2.119* 3.929±0.917#ApoA1 0.010±0.007 0.007±0.001 0.008±0.005 0.001±0.004 ApoB 0.028±0.014 0.028±0.009 0.022±0.017 0.054±0.037

3.各組免疫組織化學分析結果 免疫組化顯示，棕黃色陽性顆粒主要表達在模型小鼠主動脈內皮細胞的細胞膜上。空白對照組均未見明顯的VEGF蛋白的表達。ApoE（-/-）AS模型組中VEGF蛋白表達量明顯大于空白對照組（P＜0.05）；ApoE（-/-）陰性對照組中主動脈VEGF蛋白表達量與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＞0.05）；EMMPRIN單克隆抗體干預組中主動脈VEGF蛋白表達量明顯降低，與As模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 FGP-2的mRNA相對表達量 圖2 VEGF的mRNA相對表達量 圖3 FGP-2和VEGF蛋白的表達量 A：空白對照組，B：ApoE（-/-）陰性AS組，C：ApoE（-/-）陰性對照組，D：EMMPRIN單克隆抗體干預組

圖2 免疫組織化學分析的結果（400X）

討論

動脈粥樣硬化是個逐漸變化的過程，始于內皮細胞的病變，然后伴隨脂質沉積、炎癥細胞浸潤等密切相關[9-11]。本文就EMMPRIN單克隆抗體對于As的作用機制，以及探討是否作用于細胞的內質網應激機制[12-15]。根據預實驗結果選擇100μg EMMPRIN單克隆抗體腹腔注射給藥。

TG、TC、HDL-C、LDL-C，是導致As和各種心腦血管疾病的首要因素[16]。最近研究認為，LDL-C是唯一能將膽固醇帶入血管壁內皮細胞的脂蛋白，是促進As斑塊形成的關鍵物質。本研究通過檢測TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量來驗證造模的成功與否，結果顯示，ApoE（-/-）AS組與ApoE（-/-）陰性對照組相比，均差異有統計學意義（P＜0.05），證明了實驗As模型構建成功。另外，本研究還以TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量變化來檢測EMMPRIN單克隆抗體對As的治療作用，結果顯示EMMPRIN單克隆抗體治療組中TG、TC、LDL-C等明顯低于ApoE（-/-）AS組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明EMMPRIN單克隆抗體對As的發展進程具有明顯的抑制與治療作用。EMMPRIN單克隆抗體治療組的HDL-C均高于AS模型對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明EMMPRIN單克隆抗體對于以HDL-C升高為主的高脂血癥與As同樣具有一定的抑制與治療作用。ApoE（-/-）AS組與ApoE（-/-）陰性對照組生化指標中的載脂蛋白A1和載脂蛋白B的比較，均差異有統計學意義（P＜0.05），進一步說明了本實驗As的構建成功。而EMMPRIN單克隆抗體對于As具有明顯的抑制作用。

為探究EMMPRIN單克隆抗體在As的機制中是否與內質網應激[17]相關，本研究采用RT-PCR、Western-Blot和免疫組化等半定量的實驗方法，比較內質網應激標志蛋白VEGF蛋白[18]和FGP-2蛋白[19]以上四組細胞中的表達量?？瞻讓φ战M均未見明顯的VEGF蛋白和FGP-2蛋白的表達。EMMPRIN單克隆抗體治療組中主動脈VEGF蛋白表達量與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＞0.05），說明EMMPRIN單克隆抗體可以抑制VEGF蛋白的表達，從而證明EMMPRIN單克隆抗體可以通過內質網應激標志蛋白VEGF和FGP-2蛋白作用于動脈的內皮細胞，從而抑制As。

綜上所述，EMMPRIN單克隆抗體通過抑制內質網應激VEGF蛋白和FGP-2蛋白的表達發揮其抑制As的作用。