阿托伐他汀通過TGFβ1/miRNA208a信號抑制擴張型心肌病大鼠心肌膠原蛋白I的表達

趙明明 張金祝 李海德 尹桂華 姚宗芹 宋 杰 趙 蒙 付存玉

擴張型心肌病是一類以心力衰竭、猝死、惡性心律失常為臨床表現的常見心肌病。給患者家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。心肌纖維化是促進擴張型心肌病心功能惡化的關鍵因素[1]。逆轉心肌纖維化可能是治療擴張型心肌病的重要靶點，但擴張型心肌病心肌組織纖維化的發生發展機制目前尚不清楚。有研究表明轉化生長因子β1（TGP-β1）/miRNA208a在多種病因所致心肌纖維化的發生、發展中皆起到重要作用[2]。但該信號通路是否在擴張型心肌病心肌纖維化中也起到重要作用，目前尚不清楚。

阿托伐他汀是一種新型羥甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶抑制劑，具有降脂、抗炎、降低TGP-β1的表達等作用[3]。本研究擬使用阿托伐他汀作為干預措施，觀察擴心病大鼠心肌組織中miRNA208a、TGP-β1、膠原蛋白I（COL-1）等指標，探討阿托伐他汀對擴心病大鼠心肌組織纖維化的影響及其機制，從而為阿托伐他汀在擴張型心肌病中的應用提供實驗依據。

材料與方法

1.實驗材料 （1）實驗動物：健康雄性，Wistar大鼠30只，7周齡，體質量220～240 g，購自山東省實驗動物中心。隨機分為正常對照組、擴張型心肌病（dilated cardio myopathy，DCM）模型組，阿托伐他汀處理組，每組10只。

（2）主要試劑及儀器：阿霉素（10 mg/瓶，共6瓶）購自北京嘉林藥業有限公司。兔抗大鼠多克隆抗體、HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司，阿托伐他汀片（20 mg/片，共7片）由瑞輝公司友情提供。

（3）動物模型制備：采用連續腹腔注射阿霉素法（2.5 mg·kg-1·w-1）制備擴張型心肌病大鼠模型[1]。

（4）正常對照組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，共6周。模型制備成功后，阿托伐他汀處理組給予（12 mg·kg-1·d-1）灌胃。正常對照組、擴張型心肌病模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，共12周。

2.觀察指標及方法 （1）大鼠心功能及基本指標：實驗12周時，應用動物心臟彩超（HRQ-230 A）獲取實驗動物心功能相關指標，稱量體質量，2%戊巴比妥鈉針左下腹腔注射充分麻醉后，取出各組大鼠心臟，用0.9%氯化鈉溶液清洗，稱各大鼠心臟質量。

（2）HE染色法觀察心肌病理學變化：4%甲醛溶液固定心肌組織，石蠟包埋，切片。石臘切片依次放入二甲苯，乙醇脫蠟，用蒸餾水浸洗后，蘇木紫染色，0.1%鹽酸乙醇分化；浸泡伊紅液染色，風干后中性樹膠封片，鏡檢觀察。

（3）Masson染色觀察心肌組織中膠原纖維的表達及含量：石蠟切片常規脫蠟至水洗；Weigert鐵蘇木精染液染核，1%鹽酸酒精分化，麗春紅酸性品紅染液染色，1%磷鉬酸溶液分化，甩干，苯胺藍染液復染，1%冰醋酸沖洗切片，快速水洗后，乙醇脫水，二甲苯透明、風干后中性樹膠封片，鏡檢并攝片；隨機選取5個視野，Olmpus-BX50顯微鏡攝像系統攝像，膠原纖維呈藍色，肌肉、胞漿呈紅色，細胞核呈藍黑色。用高清晰彩色圖文報告分析系統分析，計算每個視野的心肌膠原面積與心肌總面積比值即心肌膠原容積分數。

（4）RT-PCR檢測心肌組織中TGP-β1、miRNA208a、內皮素（ET）、βMHC、COL-1表達水平：Trizol法提取總RNA，嚴格按RT-PCR試劑盒說明操作，各檢測指標引物序列如下：GAPDH上游5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下 游：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；TGP-β1上 游：5′-GCGATCTAACCTGTTGCCTG-3′，下 游：5′-AGCCATGGAGTAGACATCCG-3′；βMHC上 游：5′-TACGATTATGCGTTCTTCTCCC-3′，下 游：5′-TCCTCCCTCTGCTTCTGTTTG-3′；ET上游：5′-TGTGTCTACTTCTGCCACCT-3′，下游：5′-CTGCATGGTACTTTGGGCTC-3′；COL-1上 游：5′-TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3′，下 游5′-GAATCCATCGGTCATGCTCT-3′；U6上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下 游5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′；hsa-miR208a-5p loop primer5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTTTTG-3‘F primer 5′-TGCGCATAAGACGAGCA-3′mircoRNA反義鏈通用引物序列5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。RT-PCR反應條件：50℃2 min，95℃10 min；95℃30 s，60℃30 s，40個循環。繪制溶解曲線，最終數據以2-△△Ct進行分析。（RT-PCR儀器型號QuantStudio 6）

（5）Western blot法檢測心肌組織中TGP-β1、ET、βMHC、COL-1表達水平：石蠟組織切片脫蠟后行抗原修復封閉，然后分別滴加兔多抗GAPDH抗體（1:1 000稀釋），鼠單抗ET（1:1 000稀釋），鼠單抗βMHC（1:500稀釋），兔多抗TGFβ1（1:1 000稀釋），鼠單抗COL-1（1:1 000稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗去多余一抗后分別滴加封閉液稀釋（1:50 000稀釋）的HRP標記羊抗小鼠、羊抗兔二抗。TBST洗去多余二抗后滴加工作液覆上保鮮膜，X光膠片壓片、顯影、定影、沖洗膠片用BandScan分析膠片灰度值。

3.統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。所有計量數據用均數±標準差表示，三組間比較采用單因素方差分析分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.動物心臟彩超結果 實驗動物心臟彩超結果表明，與對照組相比，擴心病模型大鼠心臟指數增加，大鼠LVEF降低，LVEDD明顯增大，差異具有統計學意義。阿托伐他汀組與擴心病組比，LVEF提高、LVEDD減少，差異具有統計學意義。詳見表1。

表1 兩組大鼠心臟彩超結果比較（）

表1 兩組大鼠心臟彩超結果比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05，與擴心病組相比，#P＜0.05

項目 對照組（n=9）擴心病組（n=9）阿托伐他汀組（n=9）體質量/g 367±15.5 250.5±15.6* 296.1±24.4#心臟指數/（mg/g） 2.02±0.1 2.89±0.43* 2.28±0.27#LVEDD/mm 6.34±0.39 7.60±0.52* 6.85±0.26#LVESD/mm 3.25±0.38 3.76±0.16* 3.41±0.15#LVEF% 91.3±1.65 74.1±2.78* 78.6±2.55#

2.心臟HE染色結果 對照組心肌纖維走形正常，排列緊密，心肌細胞結構清晰；擴心病組心肌纖維走形一致，細胞間質模糊，細胞肥大、水腫。阿托伐他汀組仍見細胞肥大、水腫。心肌纖維排列稀疏，走形基本正常（圖1）。

3.Masson染色結果 對照組心肌間質見少量膠原纖維分布，擴心病組膠原纖維較對照組明顯增多（P＜0.05），而經阿托伐他汀處理后心肌間質膠原纖維含量降低（P＜0.05，圖2）。

4.RT-PCR結果 與對照組相比，擴心病組microRNA208a表達量及TGFβ1、ET、βMHC、COL-1 mRNA的表達量明顯增加，差異具體統計學意義（P＜0.05）。與擴心病組相比，阿托伐他汀大鼠心肌組織中microRNA208a表達水平及TGFβ1、ET、βMHC、COL-1 mRNA的表達水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖3）。

5.Western blot結果 與對照組相比，擴心病組TGFβ1、內皮素（ET）、βMHC、膠原蛋白1（COL-1）蛋白的表達量明顯增加，差異具體統計學意義（P＜0.05）。與擴心病組相比，阿托伐他汀組大鼠心肌組織中TGFβ1、ET、βMHC、COL-1蛋白的表達量降低（P＜0.05）結果與RT-PCR檢測的上述指標的mRNA的表達水平一致。差異具有統計學意義。提示阿托伐他汀可減輕擴心病大鼠模型心肌組織中TGFβ1、ET、βMHC、COL-1的過表達（圖4）。

圖1 各組大鼠心肌組HE染色（×400）A：對照組；B：擴心病組；C：阿托伐他汀組

圖2 各組大鼠心肌組Masson染色（×400）A：對照組；B：擴心病組；C：阿托伐他汀組

圖3 各組microRNA208a及TGFβ1、ET、βMHC、COL1的mRNA表達量 A：三組miRNA208a表達量的比較；B：三組TGFβ1mRNA表達量的比較；C：三組ET mRNA表達量的比較；D：三組βMHC mRNA表達量的比較；E：三組COL1 mRNA表達量的比較；注：與對照組相比，*P＜0.05，與擴心病組相比，#P＜0.05

圖4 各組microRNA208a及TGFβ1、ET、βMHC、COL1的mRNA表達量A：對照組；B：擴心病組；C：阿托伐他汀組；注：與對照組相比，*P＜0.05，與擴心病組相比，#P＜0.05

討論

心肌纖維化是擴張型心肌病的重要病理生理變化。高糖可通過TGP-β1/Smad2信號通路促進心肌纖維化，導致心功能下降[5]。抑制該信號通路則可減輕心肌纖維化程度[6]。ERK1/2可通過TGFβ1信號旁路促進骨膜素的表達。而骨膜素是心肌纖維化的關鍵調節因子[7]。TGP-β1可促進Rho相關激酶（ROCK）過表達，從而抑制BMP-2的表達，促進心肌組織纖維化[8]。除此以外，TGFβ1還可以與血管緊張素轉化酶2型受體結合直接導致纖維組織生成和膠原蛋白表達增多。減少TGP-β1的表達可能為一種逆轉心肌纖維化的重要方法。

miRNAs是一類大小約22核苷酸的非編碼RNA，多種miRNA參與了心肌纖維化的發生、發展[9-11]。miRNA208a是miRNA208家族一員，由β—MHC基因編碼，特異性表達于心肌組織。在心肌梗死大鼠模型中，miRNA208a促使心肌纖維化、肥大。降低miRNA208a的表達，可減輕心肌纖維化的程度[12]。抑制miRNA208a的表達可減輕高鹽飲食大鼠心肌肥厚及周圍血管纖維化程度[13]。機械牽張H9C2細胞可通過TGP-β1刺激miRNA208a的表達，從而促進心肌細胞肥大及內皮素、COL-1生成[14]。miRNA208a主要通過其靶標內皮素、β-MHC發揮其致心肌纖維化及心肌細胞肥大作用。內皮素是一種跨膜糖蛋白，與TGFβ1具有共同受體。可調節TGFβ1在細胞外基質中的合成作用。目前已有研究表明miRNA208a與擴張型心肌病患者的LVEF成正相關，與左心室收縮末期容量指數呈負相關。是很強的心臟不良事件發生率及心臟源猝死的重要預測因子，但其在擴張型心肌病的發生、發展中發揮作用的具體機制目前尚不清楚[15]。

本研究應用阿霉素制造擴張型心肌病大鼠模型，心臟彩超示心臟指數（mg/g）LVEDD、LVESD均明顯增大。免疫組織化學進一步提示心肌間質纖維化程度較正常對照組重。同時我們發現其心肌組織TGP-β1、miRNA208a、內皮素、βMHC、COL-1高表達。提示TGP-β1/miRNA208a信號通路在擴張型心肌病心肌纖維化的發生發展中起到重要作用，與COL-1的高表達密切相關。因此干預此信號通路可能降低心肌纖維化程度，從而改善心功能。阿托伐他汀是一種新型羥甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶抑制劑。有研究表明，阿托伐他汀可通過抗炎作用抑制兔鈣化性主動脈瓣疾病病變發展進程[16]；可降低擴張型心肌病患者血清炎癥因子水平[17]。田艷等研究發現阿托伐他汀可降低擴張型心肌病大鼠心肌組織中TGFβ1的表達，降低心肌纖維化[18]。通過本研究，我們觀察到經阿托伐他汀處理后大鼠較擴心病組大鼠LVEDD、LVESD縮小，射血分數增高，表示阿托伐他汀具有一定改善擴心病心肌重構作用。同時通過心肌Masson染色，我們觀察到，經阿托伐他汀處理后大鼠心肌組織纖維化程度明顯降低。我們進一步證實阿托伐他汀改變了擴張型心肌病模型大鼠心肌組織中TGFβ1/miRNA208a信號通路的表達。我們推測其降低心肌纖維化的左右 與其對該信號的調節有關。其機制可能與其具有一定的抑制炎癥反應有關。

綜上所述，本實驗結果表明，阿托伐他汀具有一定減輕擴心病大鼠心肌纖維的作用，該作用與 可能與其抑制TGFβ1/miRNA208a信號通路，降低COL-1的表達相關。但對其具體藥理作用機制尚需進一步研究；阿托伐他汀抗炎、抗氧化作用是否與該途徑有關仍需進一步研究。