膠體金免疫層析法快速測定蜂膠及蜂膠乙醇提取物中氯霉素殘留

周萍 李櫻紅 尹志紅 呂澤田 尹君 王靜 徐初

（1 杭州碧于天保健品有限公司，桐廬 311500；2 浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310052；3 中國蜂產品協會蜂膠專業委員會，北京 100050）

蜂膠是工蜂采集膠源植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠黏性物質[1]。蜜蜂主要用蜂膠堵塞蜂巢縫隙，以防止有害細菌、病毒或真菌的入侵，保證蜂箱潔凈衛生。蜂膠的化學成分復雜，含有多種活性物質，其功效成分主要為黃酮類、酸類、酯類化合物等[2]?！吨腥A人民共和國藥典》（2015年版一部）載明蜂膠補虛弱，化濁脂，止消渴；外用解毒消腫，收斂生肌；用于體虛早衰，高脂血癥，消渴；外治皮膚皸裂，燒燙傷[3]。蜂膠憑借獨特的醫療保健作用，正越來越受到消費者的青睞。蜂膠的活性成分和安全性已成為研究熱點。

氯霉素（CAP）是一種廣譜抗生素，是預防和治療蜜蜂細菌性疾?。乐抻紫x腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病等）的有效藥物。然而，氯霉素易在蜂產品中殘留，人們食用后會引起粒細胞缺乏病、再生障礙性貧血等[4]，美國、日本等許多國家和歐盟都禁止氯霉素在動物源性食品中檢出。中華人民共和國農業農村部第193號公告中明確指出，氯霉素禁用于所有食品動物。為了保證國內消費市場和進出口市場中蜂產品的質量，亟須開發方便有效的檢測蜂產品中氯霉素殘留的方法，以提高蜂產品的質量。

目前關于蜂蜜和蜂王漿中氯霉素檢測方法的報道比較多，主要有高效液相色譜-串聯質譜法[5-8]、氣相色譜 - 質譜法[9，10]、酶聯免疫法[11，12]等。然而，目前，尚無蜂膠中氯霉素殘留量檢測的國家標準，已報道的蜂膠中氯霉素檢測方法主要集中在高效液相色譜-串聯質譜法[13-15]。其中，周萍等[14]首次報道了液相色譜-質譜聯用技術檢測蜂膠中的氯霉素殘留，為蜂膠企業提供了氯霉素的內控檢測方法，楊黎等[15]報道了以蜂膠為主要原料的保健食品中氯霉素殘留的檢測方法，為蜂膠制品中氯霉素殘留分析提供了思路。然而，高效液相色譜-串聯質譜法對儀器要求較高，短時間內無法在蜂產品企業中普及應用，而膠體金免疫層析法[16-18]具有簡便、快速、靈敏、特異性高等優點，也不需要復雜的儀器，能在短短幾小時內檢測幾十到幾百個樣品，可適用于大規?？焖贆z測和現場監控產品中藥物殘留。

由于蜂膠的成分與蜂蜜、蜂王漿有很大差別，基質更加復雜，本文通過合適的前處理手段，首次建立了膠體金免疫層析法快速測定蜂膠及蜂膠乙醇提取物中氯霉素殘留的檢測方法，可指導蜂農對生產的蜂膠原料進行質量控制，為蜂膠收購者提供蜂膠原料或者蜂膠提取物中氯霉素殘留量的快速監測與篩查，從而保證蜂膠源頭的品質，進而保證蜂膠制品的品質。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Sartorius BS224S電子天平（德國賽多利斯公司），Philips HR2100/40攪拌機（飛利浦（中國）投資有限公司），Philips HP8260電吹風機（飛利浦（中國）投資有限公司）。

氯霉素（chloramphenicol，CAS：56-75-7，純度＞99.9%）購自美國Sigma-Aldrich公司，乙腈為色譜純（德國Merck公司），氫氧化鈉、高氯酸、氯化鈉、乙酸乙酯、正己烷等均為分析純，水為娃哈哈純凈水或相當者，CAP-203氯霉素免疫膠體金快速檢測試劑板購自杭州南開日新生物技術公司。

蜂膠和蜂膠乙醇提取物由中國蜂產品協會蜂膠專業委員會提供。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 氯霉素標準儲備液

取氯霉素標準品10mg，用乙腈定容至10ml，混勻，于-18℃冰箱保存，可保存24個月。

1.2.2 氯霉素標準中間液

吸取適量1.0mg/ml的標準儲備液，用乙腈稀釋成濃度為0.1μg/ml的標準中間液，于4℃冰箱保存，可保存6個月。

1.2.3 氯霉素標準使用液

臨用時吸取氯霉素標準中間液100μl，用娃哈哈純凈水稀釋定容至10ml，混勻，即得濃度為1μg/l的氯霉素標準使用液。

1.3 樣品制備

取蜂膠原料適量于攪拌機塑料杯中，粉碎30s，取下塑料杯，混合一次繼續粉碎30s，如此3～5次，取砂粒狀較細的物料用于檢測。當膠含量大于30%時，需要冷藏2h再進行粉碎。

1.4 樣品處理

向50ml塑料離心管中加入8ml蜂膠溶解液A（5%氫氧化鈉溶液）和8ml水，混合均勻，稱入蜂膠原料4g（或蜂膠乙醇提取物稱取3g），擰緊瓶蓋，在掌心上輕輕拍打5min，使蜂膠溶解，加入蜂膠沉淀劑B（20%高氯酸溶液），用力震搖1min，過濾，收集全部濾液。加入0.25ml堿化劑C（80%氫氧化鈉溶液），混合均勻，加入16ml乙酸乙酯，充分振蕩1min，靜置2～5min，吸取上層清液于蒸發皿中，用電吹風機吹干。加入4ml 1mol/l氯化鈉水溶液（含5%（V/V）乙醇）使溶解，加4ml乙酸乙酯，充分振蕩1min，靜置2～5min，吸取上層清液于蒸發皿中，用電吹風機吹干，加入5滴復溶液（氯霉素免疫膠體金快速檢測試劑板自帶）反復吹吸蒸發皿上的殘渣，直到全部溶解。加入1ml正己烷，反復吹吸樣液和正己烷，靜置分層2min，樣液層待測定。

1.5 測定

1.5.1 具體操作

取出氯霉素免疫膠體金快速檢測試劑板，置于水平臺面上，直至恢復至室溫。吸取“1.4”中蒸發皿里的全部樣液層，加至加樣孔中，在10min后目測讀取結果。

1.5.2 空白對照

每批樣品需做一孔空白對照，以復溶液代替試樣提取液，按“1.5.1”進行。

1.5.3 平行測定

設定每個樣品的平行樣數量≥2，各自按“1.4”和“1.5.1”進行。

1.5.4 檢測限試驗

稱取陰性蜂膠原料樣品4g（或蜂膠乙醇提取物稱取3g），加入1μg/l的氯霉素標準使用液400μl（蜂膠乙醇提取物樣品則加600μl），相當于添加量水平蜂膠原料為0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物為 0.2μg/kg。

注：不同試劑板制造商的產品組成和操作會有細微的差別，應嚴格按說明書要求規范操作。

2 結果與討論

2.1 樣品凈化方法優化

蜂膠溶解液A用于溶解蜂膠中氯霉素和其他水溶性活性物質，蜂膠沉淀劑B用于沉淀蜂膠中的樹脂類、蜂蠟等雜質。過濾時，蜂膠原料樣品和蜂膠提取物樣品的過濾時間因樣品不同略有差異。由于不同來源的蜂膠樣品差異較大，過濾后的樣品或澄清或不澄清，這是因為蜂膠原料中存在某些蛋白質、膠體、雜質，不影響后續操作。

濾液中加入堿化劑后，其有機酸、蛋白質、膠體、酚類、黃酮類化合物形成鹽類，此時加入乙酸乙酯振蕩，可充分提取氯霉素。由于乙酸乙酯微溶于水，振蕩時可能使樣液乳化，影響分層效果。經過多次預試驗，加入16ml乙酸乙酯可充分保證提取和分層效果，故乙酸乙酯添加量確定為16ml。在靜置時管壁可能粘附有樣液，吸取乙酸乙酯層時易被誤吸入，此時，可以用手輕敲管壁，管壁振動使樣液自然落下，再靜置幾分鐘即可吸取乙酸乙酯層。

將乙酸乙酯提取液置于90cm蒸發皿中，用電吹風機吹干。一般膠體金快速檢測方法推薦的乙酸乙酯層吹干方法是將液體置于窄口的離心管中，由于管口較窄，不利于熱風進入，也不利于乙酸乙酯揮發，比較耗時。本方法將乙酸乙酯層置于敞口的蒸發皿中，方便吹干，實踐表明吹干時間平均為6min，速度非常快。

蒸發皿中的殘渣只需滴加0.16ml氯霉素復溶液就可以溶解，具體操作時用1ml滴管滴加5滴氯霉素復溶液，先沖洗浸潤然后用滴管反復吹吸殘留物，浸潤過的殘留物很容易被溶解在復溶液中。最后，將滴管頭部浸在復溶液中，復溶液會全部虹吸到滴管中，全部滴加到氯霉素免疫膠體金快速檢測試劑板的加樣孔中即可檢測。

為了降低方法的檢測限，本方法增加了鹽析凈化過程，大幅度降低了雜質水平，減少干擾，從而降低了本方法的檢測限。

2.2 結果及表述

結果判讀見圖1。

無效：如空白對照控制線（C線）不出現紅色條帶，說明檢測試劑板失效或操作不當，為無效結果，不能進行檢測。

陰性：試樣檢測線（T線）出現紅色條帶，且顏色比控制線（C線）深或一樣深，結果為陰性（蜂膠原料氯霉素殘留量＜0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物＜0.2μg/kg）。

圖1 結果示意圖

陽性：試樣檢測線（T線）出現紅色條帶，但顏色比控制線（C線）淺或檢測線（T線）未出現紅色條帶，結果為陽性（蜂膠原料氯霉素殘留量≥0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物≥0.2μg/kg）。

2.3 檢測限與回收率

分別取0.3μg/l、1μg/l濃度的標準溶液5滴點到試劑板樣品孔中，5min后目測，0.3μg/l標準溶液的C線比T線的顏色淺，1μg/l標準溶液的C線比T線的顏色明顯更深，所以，試劑板檢測氯霉素的靈敏度是1μg/l。

取陰性蜂膠原料樣品，分別加入0.1μg/kg和0.2μg/kg添加水平的氯霉素，按本方法檢驗，0.1μg/kg、0.2μg/kg添加時均可得到陽性結果。取陰性蜂膠乙醇提取物樣品，分別加入0.1μg/kg和0.2μg/kg添加水平的氯霉素，按本方法檢驗，0.1μg/kg的C線比T線的顏色不能更深，0.2μg/kg添加時可得到陽性結果。由此可見，本方法蜂膠原料檢測限為0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物檢測限為0.2μg/kg。

按蜂膠原料中乙醇提取物含量為30%計，在本方法檢測限以下的蜂膠原料，加工成提取物時，氯霉素殘留最高值0.3μg/kg，蜂膠制品中的蜂膠乙醇提取物含量為30%時，可滿足限量0.1μg/kg的要求。蜂膠乙醇提取物檢測限為0.2μg/kg，蜂膠制品中的蜂膠乙醇提取物含量為50%時，可滿足限量0.1μg/kg的要求。

2.4 與質譜結果的一致性驗證

取28份蜂膠樣品，分別采用本文的膠體金免疫層析法和高效液相色譜-串聯質譜法[14]進行檢測，結果見表1。由表中可見，膠體金免疫層析法的結果與液質確證結果一致，假陽性率和假陰性率均為0%，說明方法準確可行。

從數據上看，采用本文的膠體金免疫層析法檢測到8個陰性樣品，說明均在檢測限以下，高效液相色譜-串聯質譜法檢測結果均為＜0.1μg/kg，假陰性率均為0%。采用本文的膠體金免疫層析法檢測到20個陽性樣品，高效液相色譜-串聯質譜法檢測氯霉素為0.11～22.9μg/kg，假陽性率均為0%。其中有3個樣品T線、C線同時顯色，且C線顏色稍深，高效液相色譜-串聯質譜法檢測氯霉素為0.11～0.13μg/kg，證實氯霉素殘留處于較低水平，稍高于檢測限而呈弱陽性。其余膠體金免疫層析法檢測為陽性的17個樣品，高效液相色譜-串聯質譜法檢測到的氯霉素為0.34～22.9μg/kg，其中0.34μg/kg～0.53μg/kg的樣品T線、C線同時顯色，且C線顏色明顯較深，而0.67μg/kg的樣品T線幾乎不顯色了。綜上所述，膠體金免疫層析法與高效液相色譜-串聯質譜法檢測氯霉素結果完全一致，未出現假陰性與假陽性的情形。

此外，本方法已經經過杭州天廚蜜源保健品有限公司驗證，驗證樣品的檢測結果與方法開發者一致。

表1 膠體金免疫層析法和高效液相色譜-串聯質譜法氯霉素結果判定表

2.5 檢測時間

按本方法檢測，單個樣品用時約30min，同時檢測6個樣品，需時2.5h，平均每個樣品需時25min。

3 結論

（1）本文首次采用膠體金免疫分析方法對蜂膠及其乙醇提取物中的氯霉素殘留量進行了研究。樣品在堿性條件下溶解稀釋，20%高氯酸溶液除雜過濾后，加入堿化劑適量，經乙酸乙酯提取，鹽析凈化后，再用乙酸乙酯提取吹干，加入正己烷和復溶液溶解后，用膠體金快速檢測試劑板快速檢測。結果表明，膠體金免疫層析法對蜂膠及蜂膠提取物中氯霉素殘留量的檢測限分別為0.1μg/kg和0.2μg/kg。經高效液相色譜-串聯質譜確證，假陽性率和假陰性率均為0%。本方法操作簡便快速、重復性好、靈敏度高、準確度好，是蜂膠源頭收購中監控蜂膠中氯霉素殘留量的有效實用的方法。

（2）按本文建立的方法對中國蜂產品協會蜂膠專業委員會的28份蜂膠樣品進行氯霉素殘留量測定，陰性率僅為28.6%，從結果看，蜂膠中氯霉素殘留量情況不容樂觀。蜂膠已經被公認為是良好的保健食品原料和中藥，需要業內人士借助本檢測方法的應用努力解決此安全問題。

（3）氯霉素是動物禁用藥物，在蜂產品行業，自2001年以來，氯霉素問題通過業內人士的共同努力，在蜂王漿、蜂蜜等蜂產品原料中已經基本檢測不到氯霉素了。蜂膠屬于脂溶性物質，與氯霉素有高度的相溶性，由于蜂膠長期粘附在巢框、箱蓋中，每次取膠時不能全部從上面取凈，導致下次取膠時不同程度留有上次的蜂膠。2010年，周萍等[14]檢測到的蜂膠原料中氯霉素殘留量遠高于本次28個樣品，側面說明我國蜂膠原料中的氯霉素殘留量正在逐年減少。

（4）為了解決蜂膠中的氯霉素問題，本文做如下建議：如果蜂群所取蜂膠氯霉素陽性，建議全新更換蜂箱、巢框；蜂農用藥時，對蜂藥中的禁用藥物進行檢測，堅決不用含有禁用藥物的蜂藥；對周邊環境、水源進行調查，必要時可以取水樣檢測氯霉素殘留量。