蜂產品中新煙堿類農藥檢測前處理方法研究進展

伍思源 陳文彬 涂熹娟 繆曉青,

（1 福建農林大學食品科學學院，福州 350002；2 福建農林大學蜂學學院，福州 350002）

蜂產品質量安全決定了養蜂業的經濟效益，農獸藥殘留是引起蜂產品質量下降的重要因素之一，然而蜂產品樣品基質復雜，需要經過提取、凈化、濃集等一系列步驟才能用于儀器檢測。因此，需要開發簡單、快速、有效、穩定的前處理方法用于蜂產品中農獸藥殘留的檢測。

新煙堿類農藥是一種相對較新的類尼古丁農藥，作用于昆蟲的煙堿型乙酰膽堿受體，是世界上應用最廣泛的農藥之一。過量使用新煙堿類農藥可能直接污染蜂產品，也可能通過污染環境如土壤、水源、蜜粉源植物等間接污染蜂產品。目前，檢測蜂產品中新煙堿類農藥的前處理方法主要有固相萃?。⊿PE）、液液萃取（LLE）、QuEChERS等。

1 蜂蜜

蜂蜜有豐富的營養成分，含有大量的糖類物質，此外還包括微量元素和生物活性物質，如酚類化合物、礦物質、蛋白質、有機酸、游離氨基酸、酶和維生素等[1]，這也使得蜂蜜基質比較復雜。蜂蜜中新煙堿類農藥檢測的前處理方法總結于表1中。

Fidente P[2]等人將SPE應用于蜂蜜中新煙堿類農藥的檢測。該研究將蜂蜜溶于純水中，然后轉移到含硅藻土的SPE柱中，用二氯甲烷洗脫SPE柱。通過LC-ESI-MS分析了4種新煙堿類農藥。

Song SM[3]等人使用一次性移液器提取法（DPX）測定了蜂蜜中的8種新煙堿類農藥。該文獻研究了2種離子交換劑（QAE Sephadex A-25和SP Sephadex C-25），發現QAE Sephadex A-25陰離子交換劑效果更好。此外，還對比了陰離子交換劑-DPX法和QuEChERS法，結果顯示離子交換劑-DPX法不但回收率更高，而且可以凈化糖、水溶性色素、無機鹽等物質，從而降低基質效應甚至可以不考慮基質效應。

Jovanov P[4]等人將分散液液微萃取（DLLME）用于蜂蜜樣品前處理方法，使用液相色譜-串聯質譜法測定了蜂蜜樣品中的7種新煙堿類農藥。該研究將乙腈作為分散劑，二氯甲烷作為提取劑處理蜂蜜樣品。然后經過渦旋、超聲、離心、干燥、復溶等步驟，通過LC-MS/MS進行檢測。

Malgorzata Gbylik-Sikorska[5]等人測定了蜂蜜樣品中多達13種目標物。該研究將蜂蜜加入到含有水、乙腈、乙酸乙酯、三乙胺的混合溶液中，渦旋、超聲、離心后將上清液轉移到SPE柱中。用乙腈和乙酸乙酯混合物作為洗脫液洗脫兩次，該研究發現在提取劑中加入三乙胺-乙腈溶液可以提高回收率。

Gina Tanner[6]等人比較了兩種前處理方法（SPE和QuEChERS）測定蜂蜜中的8種新煙堿類農藥及2種代謝物。SPE方法是將蜂蜜溶于水中，再加入甲醇，用濾紙過濾，硅藻土作為助濾劑。然后把濾液中的有機溶劑蒸發干燥，將水溶液轉移到ChemElut 1020柱上，用環己烷和乙酸乙酯混合溶液洗脫。QuEChERS方法是將蜂蜜溶于水和乙腈中，加入無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉，進行提取，將上清液轉移到含有無水硫酸鎂和PSA的離心管中凈化。結果顯示，SPE方法對于烯啶蟲胺和呋蟲胺的回收率較低；而采用QuEChERS方法處理蜂蜜樣品，回收率得到了顯著提高。此外，Bridi R[7]等人也用QuEChERS方法，通過LC-MS/MS分析了智利地區蜂蜜中的4種新煙堿類農藥。

Campillo N[8]等人提出了固相萃取與分散液液微萃?。⊿PE-DLLME）相結合的方法測定蜂蜜中5種新煙堿類農藥。該研究將蜂蜜溶于水中，轉移至SPE小柱，用乙腈洗脫。隨后進行DLLME步驟：將SPE的洗脫液轉移到氯化鈉水溶液中，加入CHCl3作為提取劑，離心后收集下層溶液，干燥復溶，注入LC系統。該研究還比較LC-DAD和LC-MS/MS的結果。

在國內，李菊穎[9]等人用QuEChERS方法處理蜂蜜樣品，用乙腈和水作為提取劑，PSA和無水硫酸鎂作為凈化劑處理蜂蜜樣品，然后通過UPLC-MS/MS同時測定了蜂蜜中的6種新煙堿類農藥。粟有志[10]等人用水作為提取劑加入到蜂蜜中，用PSA和酸性Al2O3凈化樣品，通過LC-MS測定了蜂蜜中的9種新煙堿類農藥。王東[11]等人采用鹽析輔助均相液液萃取結合分散固相萃取法處理蜂蜜樣品，該研究在蜂蜜中加入水和乙腈，并且加入氯化鈉進行提取，取上清液加入無水硫酸鎂和PSA凈化。呂冰[12]等人也是在乙腈水體系中加入氯化鈉進行提取，但是用PPVP進行凈化。因為PPVP不僅能除去蜂蜜中的酚酸類物質，而且價格比較便宜。

表1 蜂蜜中新煙堿類農藥檢測的前處理方法總結

2 蜂花粉

蜂花粉是蜜蜂采集時帶回的花粉團，營養成分包括碳水化合物、蛋白質、脂類、維生素、礦物質、多酚和少量其他成分[13]。由于其復雜的基質組成，加大了樣品提取、凈化的難度。蜂花粉中新煙堿類農藥檢測的前處理方法總結于表2中。

Olalla Ló pez-Fernández[14]等人在研磨過的蜂花粉中加入純水、乙腈、無水硫酸鎂、乙酸鈉進行提取。搖動、離心后取上清液，再次加入硫酸鎂去除水分，再離心取上清液過SupelcleanTMENVI-Carb II/PSA柱，用乙腈洗脫，將洗脫液用氮氣吹干，加水復溶，然后通過HPLC-MS/MS分析了7種新煙堿類農藥。

Mei Chen[15]等人測定了蜂花粉中的8種新煙堿類農藥。該研究將蜂花粉研磨成細粉，加入水、乙腈和正己烷搖勻后，加入一個QuEChERS試劑盒和一個陶瓷均質機充分提取，用含有PSA、C18和MgSO4的d-SPE小瓶凈化。Valverde S[16]等人也采用QuEChERS方法處理蜂花粉樣品，同時測定了樣品中的7種新煙堿類農藥。不同之處在于提取上清液后會放置在有干冰的聚苯乙烯盒中2min，以沉淀脂肪和蛋白質。

Karen P.Yá ?ez[17]等人使用了一種十分簡單的前處理方法處理蜂花粉樣品，測定了樣品中的7種新煙堿類農藥。該方法將二氯甲烷加入花粉中，振動混合，離心，提取上清液，用濾紙過濾，蒸發干燥，用乙腈水復溶。該方法與其他方法相比較為簡單、快速。

3 蜂王漿

蜂王漿是一種功能性食品，在營養學和化妝品中具有潛在價值，其主要成分是蛋白質、碳水化合物以及脂質[18]。蜂王漿中新煙堿類農藥檢測的前處理方法總結于表3中。

侯建波[19]等人采用QuEChERS方法處理蜂王漿樣品，通過LC-MS/MS測定樣品中的10種新煙堿類農藥及2種代謝產物。該研究用水和甲醇提取蜂王漿中的農藥，PSA、C18和無水MgSO4作為分散劑凈化樣品。干燥樣品后，用甲酸水-甲醇溶液復溶。

Silvia Valverde[20]等人測定了兩種不同蜂王漿產品（液體膳食補充劑和新鮮蜂王漿）中的7種新煙堿類農藥。根據該研究報道，液體膳食補充劑使用SPE處理，將液體膳食補充劑用甲酸銨水溶液稀釋，采用SPE試劑盒，用甲醇和乙酸乙酯混合液洗脫。而新鮮蜂王漿則使用DLLME方法處理，將新鮮王漿用乙腈和氯仿進行提取，而且加入兩次氯仿，重復提取。對于液體膳食補充劑，他們還同QuEChERS方法進行對比，但是QuEChERS方法會形成一個界面，難以收集上清液，因此使用SPE方法。對于新鮮王漿，他們也同SPE方法和QuEChERS方法進行了對比，但是結果發現SPE方法會堵塞SPE柱，QuEChERS方法也會形成一個界面，所以最后選擇了DLLME方法進行前處理。

表2 蜂花粉中新煙堿類農藥檢測的前處理方法總結

表3 蜂王漿中新煙堿類農藥檢測的前處理方法總結

表4 蜂蠟中新煙堿類農藥檢測的前處理方法總結

4 蜂蠟

蜂蠟主要由脂肪酸、脂肪醇、鏈烷烴和游離脂肪酸的混合物組成。養蜂活動中使用的新煙堿類農藥具有低揮發性和持久性[21]，而且，養蜂實踐中，通常會熔化舊的蜂蠟作為制造新蜂蠟的原料，所以新煙堿類農藥在蜂蠟上可能逐漸積累。蜂蠟被污染，意味著相關的蜂產品也有被污染的風險[22]。蜂蠟中新煙堿類農藥檢測的前處理方法總結于表4中。

Karen P.Yá nez團隊于2013年發表了一篇測定蜂蠟樣品中吡蟲啉的研究[23]和一篇測定蜂蠟樣品中7種新煙堿類農藥的研究[24]。他們使用LLE-SPE結合的方法處理蜂蠟樣品，在蜂蠟樣品中加入正己烷和異丙酮的混合溶液，然后加熱使蜂蠟熔化，再加水進行提取。將提取液轉移到SPE柱中，并加入丙酮洗脫。

Claire Jabot[25]等人將蜂蠟融于戊烷中，然后倒入含有硅藻土的離心管中，干燥離心管，加入酸化的乙腈溶液進行洗脫，將洗脫液放在-18℃下靜置15h，以沉淀雜質。氮吹干燥后，用甲醇水復溶，通過LC-MS檢測樣品中的新煙堿類農藥。該研究還嘗試了單一溶液和混合溶液的液液萃取，但效果不好，因此選擇了固相萃取技術。此外，他們還發現在氮吹干燥前加入二甲基亞砜可以提高回收率。

Silvia Valverde[26]等人將甲醇和乙酸乙酯的混合物作為提取劑，用干冰冷凍沉淀雜質，然后將上清液轉移到EMR-Lipid SPE管中凈化。該研究結果還顯示商業化的EMR-Lipid管能有效凈化蜂蠟基質。

5 結語

檢測蜂產品中新煙堿類農藥的前處理方法以液液萃取、固相萃取或兩種方法相結合為主。目前還出現了商品化的QuEChERS試劑盒和SPE柱，這有效減少了實驗操作時間，并且降低了實驗誤差。蜂產品中新煙堿類農藥的前處理方法日趨完善，并向簡單、快速、高靈敏度、低有機溶劑消耗、低成本的方向發展。