食管鱗狀細胞癌中單羧酸轉運蛋白4的表達及對EC109細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

劉耀河，秦 寧，楊 瑜，宋 銳，侯 歌，王 成，郭振江，梁 冰，張 艷，劉宗文

1)鄭州大學第二附屬醫院放射治療科 鄭州 450014 2)鄭州大學第二附屬醫學腫瘤內科 鄭州 450014 3)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 450001

食管癌是我國常見的消化道腫瘤，其中超過90%的病理類型都是鱗狀細胞癌(以下簡稱鱗癌)[1-2]。癌細胞的代謝模式是在氧氣充足的條件下以糖酵解為主并獲取能量，稱為 Warburg效應，且這一代謝模式的改變會產生大量的乳酸。單羧酸轉運蛋白4(monocarboxylate transporter 4, MCT4)是單羧酸轉運蛋白家族中的一員，它的主要功能是將胞內的乳酸轉運到胞外，這不僅可以維持胞外低酸的微環境，還可以讓胞內糖酵解順利進行[3-4]。作為乳酸轉運的主要參與者，MCT4在食管腺癌和胃癌等多種腫瘤中高表達，且影響預后[5-6]。有研究[7-8]發現，下調MCT4的表達以減少乳酸的外排，可以顯著減弱結直腸癌和宮頸癌細胞的惡性生物學行為。本實驗分析了食管鱗癌細胞和組織中MCT4的表達，觀察下調MCT4表達對食管鱗癌EC109細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1細胞、組織及主要試劑

1.1.1 組織來源 選取鄭州大學第二附屬醫院病理科2014至2015年的食管鱗癌組織標本60例，另取癌旁正常食管黏膜組織(距癌灶3 cm以外)19例，均經病理證實。患者手術前均未接受放化療等治療，手術方式為食管癌根治切除術。其中男39例，女21例；≥65歲28例，<65歲32例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期30例，Ⅲ+Ⅳ期30例；病理分級高中分化42例，低分化18例；有淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移29例。

1.1.2 細胞株 正常食管上皮細胞Het1-A和食管鱗癌細胞EC109和EC9706均由鄭州大學第二附屬醫院消化研究所捐贈。

1.1.3 主要試劑 鼠抗人單抗MCT4、鼠抗人單抗GAPDH和鼠抗人單抗β-tublin分別購自于美國Santa Cruz公司、武漢三鷹生物技術有限公司和Absin公司。Lipofectamine 3000購于美國Invitrogen公司。靶向MCT4的siRNA(MCT4-siR)和陰性對照siRNA(NC-siR)購于生工生物工程(上海)股份有限公司，序列見表1。通用SP免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋有限公司。凝膠制備試劑盒和CCK8 試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，Matrigel基質膠購于美國 BD公司，Transwell小室購于美國Corning公司。乳酸測定試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。

表1 siRNA序列

1.2食管鱗癌組織和細胞中MCT4蛋白的檢測

1.2.1 免疫組化法檢測組織中MCT4蛋白 將新鮮的組織標本于多聚甲醛中脫水固定，過夜后石蠟包埋，3～5 μm厚切片，然后經脫蠟、水化、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、封閉等步驟，滴加MCT4單抗(稀釋度1∶200)4 ℃過夜，滴加生物素標記山羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片。以PBS作為陰性對照。于200倍鏡下觀察，細胞膜和細胞質出現棕黃色顆粒為陽性細胞。于200倍鏡下觀察，選取5個視野，計數500個細胞。按照染色強度評分：不顯色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。按照陽性細胞百分比評分：<5%計0分，5%～計1分，10%～計2分，50%～計3分，≥75%計4分。兩項評分相加，<6分為低表達，≥6分為高表達。由兩名病理科專家使用雙盲法閱片評分，當兩人結果不一致時，請第3位病理科醫生定奪。

1.2.2 Western blot法檢測細胞中MCT4蛋白的表達 取對數生長期的Het1-A、EC109和EC9706細胞，以每孔2×105個/mL接種于6孔板中，當細胞融合度達到80%～90%時，用胰蛋白酶洗脫細胞，PBS洗滌2次，用離心管收集后加入裂解液，冰上裂解30 min，BCA法測量蛋白濃度。根據凝膠制備試劑盒說明書配制凝膠，上樣量為25 μg。恒壓90 V30 min后轉恒壓120 V，轉移至PVDF膜，恒流300 mA轉膜75 min。用含有吐溫20和脫脂乳的TBST(pH 7.8)室溫下封閉2 h；加一抗(MCT4抗體稀釋度1∶200，GAPDH抗體稀釋度1∶2 000)4 ℃孵育過夜；加二抗室溫孵育2 h；化學發光顯色，暗室曝光。實驗重復3次。用Image J進行定量分析，計算目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度值的比值，以此表示目的蛋白表達水平。

1.3下調MCT4表達后EC109細胞生物學行為的變化

1.3.1 實驗分組 取對數生長期的EC109細胞，以每孔2×105個/mL接種于6孔板。實驗分為3組，分別為空白對照組、NC-siR組和MCT4-siR組，每組3個復孔。避光條件下，當細胞融合度達到50%～60%時，NC-siR組和MCT4-siR組利用lipofectmine3000分別轉染NC-siR和MCT4-siR，饑餓轉染6 h后更換為完全培養基。

1.3.2 細胞中MCT4蛋白的表達 用胰蛋白酶將各組細胞洗脫下來，PBS洗2次，冰上裂解30 min，BCA法檢測蛋白濃度，Western blot法檢測MCT4蛋白，內參為β-tublin,方法同前。

1.3.3 細胞外乳酸含量的測定 轉染72 h后，更換新鮮培養基培養24 h,將細胞培養基轉移至EP管中，依照乳酸測定試劑盒說明書操作，用酶標儀測定530 nm處吸光度，按照公式計算細胞外乳酸含量。

1.3.4 細胞增殖能力的檢測 按照1.3.1方法處理細胞后，將 3組細胞接種于96孔板中，每孔2×103個，加入100 μL培養基培養96 h，加入10 μL CCK8溶液于37 ℃烘箱中孵育2 h，測量530 nm處的吸光度(A)。細胞增殖率=實驗組A/空白對照組A×100%。實驗重復3次。

1.3.5 細胞侵襲能力的檢測 用無血清的DMEM培養基按照8∶1的比例稀釋Matrigel基質膠，然后加入到Transwell上層小室(100 μL)，于細胞培養箱中過夜。移除基質膠，將細胞鋪于上層小室中，用含體積分數5%胎牛血清的DMEM培養基600 μL填充小室下層。24 h后，用棉簽擦去上層的細胞和基質，將小室放入無水甲醇中固定20 min，結晶紫染色,于400倍鏡下觀察。選取5個視野拍攝并計數細胞，計算平均數。侵襲率=實驗組侵襲細胞數/空白對照組侵襲細胞數。實驗重復3次。

1.3.6 細胞遷移能力的檢測 將細胞按照1.3.1方法分組培養，板中形成完整的單層細胞后，用200 μL槍頭的尖端在底部畫一條直線,用PBS清洗，加入2 mL含有體積分數2%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養。分別于培養0和24 h后鏡下拍照，用Image Pro Plus 6.0分析。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。遷移率=實驗組劃痕愈合率/空白對照組劃痕愈合率。實驗重復3次。

1.4統計學處理應用SPSS 16.0進行統計分析。食管正常及癌組織中MCT4高表達率的比較，不同臨床病理特征癌組織中MCT4高表達率的比較采用χ2檢驗；3種細胞中MCT4表達水平的比較，3組細胞中MCT4表達水平、細胞外乳酸含量的比較采用單因素方差分析；NC-siR組和MCT4-siR組細胞增殖率、遷移率及侵襲率的比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1食管鱗癌組織中MCT4的表達食管鱗癌和正常食管黏膜組織中MCT4的表達見圖1。食管鱗癌組織中MCT4高表達率為70.0%(42/60)，而正常食管黏膜組織中為26.3%(5/19)，二者比較差異有統計學意義(χ2=11.427，P<0.001)。不同臨床病理特征食管鱗癌組織中MCT4表達的比較見表2。由表2可知，高中分化癌組織中MCT4高表達率低于低分化癌組織。

圖1 食管鱗癌(A)和正常食管黏膜(B)組織中MCT4的表達(SP,×200)

例

續表1

2.23種細胞中MCT4蛋白表達水平的比較見圖2。Het1-A、EC9706和EC109細胞中MCT4蛋白表達水平分別為(0.52±0.05)、(0.84±0.04)和(0.92±0.03)，3組間差異有統計學意義(F=86.857，P<0.001)；EC9706和EC109細胞中MCT4蛋白表達水平高于Het1-A，且EC109細胞中MCT4蛋白表達水平高于EC9706(P<0.05)，故選取EC109用于后續實驗。

圖2 3種細胞中MCT4蛋白的表達

2.3下調MCT4后EC109細胞生物學行為的變化

2.3.1 3組細胞中MCT4的表達 見圖3、表3。與空白對照組和NC-siR組比較，MCT4-siR組細胞中MCT4蛋白表達水平降低(P<0.05)。

1：空白對照組；2：NC-siR組；3：MCT4-siR組

2.3.2 3組胞外乳酸含量及細胞增殖率、侵襲率、遷移率的比較 圖4和表3?？梢钥闯?，MCT4-siR組胞外乳酸含量較空白對照組和NC-siR組降低(P<0.05)，細胞增殖率、遷移率和侵襲率均較NC-siR組降低(P<0.001)。

A：空白對照組；B：NC-siR組；C：MCT4-siR組

*:與空白對照組和NC-siR組相比，P<0.05

3 討論

腫瘤細胞分泌的乳酸在腫瘤微環境中持續大量積累會反饋性抑制腫瘤細胞的能量獲取，使細胞外基質和基底膜發生降解，從而導致腫瘤細胞侵襲和遷移能力增強[9]。乳酸還可誘導轉化生長因子β2(transforming growth factor β2，TGF-β2)的表達，促使腫瘤細胞遷移能力增強[10]。因此，控制乳酸轉運的MCT4與腫瘤細胞的生長關系密切[3-4]。張寶月等[11]發現從正常宮頸上皮發展到宮頸癌的過程中，組織中MCT4蛋白表達水平不斷增加。也有文獻[5]報道在正常食管到巴雷特食管再到食管腺癌發展過程中，組織中MCT4蛋白表達水平呈線性增長。本研究結果顯示，食管鱗癌組織中MCT4蛋白的表達水平高于正常食管黏膜組織，且癌組織分化程度越低，MCT4蛋白表達水平越高；食管鱗癌細胞EC9706和EC109中MCT4蛋白表達水平高于正常食管黏膜細胞Het1-A。研究結果提示，腫瘤細胞惡性程度增加，MCT4表達水平也增加，以維持腫瘤細胞正常的能量代謝。

Voss等[12]利用吖啶黃抑制劑破壞MCT4-CD147的連接后，腫瘤細胞增殖能力下降，并在體內觀察到腫瘤血管生成受抑。氯汞苯磺酸鹽、醋酸鉛和二氯化鎘均可抑制MCT4與CD147的相互作用，造成乳酸外排減少，但是這些化合物有很大的副作用，暫時還未用于腫瘤治療[13-14]。

利用siRNA下調口腔鱗癌細胞和肝癌細胞中 MCT4 的表達后，腫瘤細胞的侵襲和轉移能力降低[15-16]。運用siRNA沉默尿路上皮癌細胞中的MCT4可造成胞內乳酸的聚集，導致細胞增殖能力下降[17]，這種增殖抑制作用在高度惡性細胞中效果更明顯[18]。前列腺癌細胞的糖酵解能力較強，會產生過多的乳酸，特異性抑制前列腺癌細胞中MCT4基因表達后，腫瘤細胞的增殖能力、糖酵解能力和乳酸分泌能力均顯著降低[19]。下調宮頸癌Hela和Siha細胞中MCT4的表達，可成功抑制腫瘤細胞的生物學行為[8]。

本實驗中我們參考郭振江等[8]設計，合成靶向MCT4的siRNA，轉染至EC109細胞后，轉染細胞細胞外乳酸含量降低，同時細胞增殖率、遷移率和侵襲率下降；提示沉默MCT4基因可以使EC109細胞的侵襲和遷移能力變弱，其作用機制可能與減少細胞外乳酸含量有關，但是具體機制還需要進一步探索。

綜上所述，MCT4在正常食管上皮進展到食管鱗癌過程中發揮了重要作用，下調其表達可以降低食管鱗癌細胞的惡性生物學行為。MCT4很可能會成為一個食管鱗癌臨床診斷和分子治療的靶點。