CD8+T細胞PD-1基因CRISPR/Cas9編輯體系電穿孔條件的優化

王淑敏，張代群，李 峰，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤中心 鄭州 450052 3)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001 4)河南省腫瘤免疫與生物治療重點實驗室 鄭州 450052

目前，免疫治療已經成為最具前景的腫瘤治療手段之一，T細胞在腫瘤免疫治療中起到關鍵作用。然而，在實體瘤腫瘤微環境中存在多種免疫逃逸機制，可以識別T細胞表面的免疫檢查點，使T細胞不能對腫瘤細胞進行有效的識別和殺傷，并且走向耗竭狀態[1]，抑制免疫檢查點可以刺激或增強抗腫瘤免疫應答[2]。PD-1存在于活化的T細胞和調節性T細胞(Treg)上，其配體PD-L1可在腫瘤細胞和樹突狀細胞[3-5]上表達。腫瘤細胞表面的PD-L1分子與T細胞表面的PD-1結合，可以抑制T細胞的免疫活性；阻斷兩者的結合，可恢復T細胞的抗腫瘤作用。成簇的規律間隔短回文重復序列(CRISPR)/CRISPR相關蛋白9(Cas9)已經成為時下最流行的可以在多種物種中進行基因編輯的工具[6]。相比于傳統重組鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)和轉錄激活因子樣效應蛋白核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)等技術，CRISPR/Cas9技術具有操作簡單、效率高、成本低的優點[7]。利用CRISPR/Cas9對人原代T細胞進行基因編輯，為基于T細胞的免疫治療提供了巨大的應用前景[8]，但CRISPR/Cas9編輯體系會對細胞活性造成一定損害。目前最普遍應用的是Lonza公司的4D-Nuleofector儀器，其配有不同的電轉緩沖液和脈沖組合，可針對各種類型的細胞進行電穿孔[9]。本文根據文獻報道和前期研究[9-10]，設計兩種電轉緩沖液和脈沖組合方案，檢測兩種方案編輯CD8+T細胞PD-1基因的效率，比較兩種方案對T細胞生物學特性的影響，旨在篩選出一種更適合T細胞基因編輯的電穿孔條件。……