云南德宏水牛和雜交牛（摩拉水牛×德宏水牛）血清中兩種同工酶的多態性研究

王婷，楊仁丹，張永云，孫政，楊忠，李衛真

( 1.云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201; 2.云南農業大學動物醫學院，昆明 650201;3.云南農業大學農科專業基礎實驗教學示范中心，昆明 650201;4.云南生物制藥有限公司，昆明 650503）

水牛奶被稱為天然的“最接近完善的食物”，其乳脂含量、乳蛋白含量均明顯高于荷斯坦牛奶[1]。其平均乳蛋白含量為4.5%，是荷斯坦牛的1.32倍，乳脂率平均為7.5%，相當于荷斯坦牛的兩倍多[2]。且水牛奶易于吸收，各種氨基酸、維生素、礦物質微量元素齊全，比例均衡，是人類理想的飲用乳品[3]。水牛奶脂肪球和酪蛋白膠粒大，風味濃郁、口感飽滿，是生產乳制品的最佳原料[4]。由于水牛奶的優異特性，其生產前景廣闊，是一種優質乳品[5]。德宏水牛是云南省優良的地方品種，具有體型大、耐粗飼及抗病力、抗逆性和役用能力強等優點。應用摩拉水牛種公牛與德宏水牛進行雜交改良，培育乳用型水牛，其產乳性能已經得到了較大提高[6]。

同工酶是指生物體內催化相同的化學反應而酶蛋白的分子結構、理化性質和免疫學性質不同的一組酶。同工酶是由染色體上不同的基因座位編碼的生化表型，能較好地反映物種間的遺傳差異[7]。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）同工酶是一種結合蛋白質，以NAD+為輔酶，催化乳酸脫氫變成丙酮酸，是糖類代謝中所必需的酶[8]。LDH普遍存在于哺乳動物的組織和體液中，由M型和H型兩種亞基根據不同的排列組合構成五種不同形式的四聚體[9]。代謝物和遺傳基因對LDH的生成有雙重控制的作用，因而LDH在電泳酶譜上出現種屬特異性和組織特異性。過氧化物酶（peroxidase，POD）同工酶是一族能利用H2O2氧化供氫體的酶，對H2O2的需求非常專一，而對供氫體的要求則比較廣泛[10]。酚類和胺類化合物、某些雜環化合物及一些無機離子等都可以作為過氧化物酶的供氫體，其主要功能是清除氨基酸分解代謝及糖醛酸合成代謝等過程中形成的過氧化物[11]。

目前，對于德宏水牛的研究主要集中在雜交改良提高產奶量方面，對血清同工酶的研究未見報道。本試驗對德宏水牛和雜交牛血清中兩種同工酶的多態性和LDH含量進行研究，結果可為德宏水牛機體免疫、代謝以及飼養管理、乳制品開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取云南省德宏州梁河縣健康的德宏母水牛28頭，芒市健康的摩拉水牛×德宏水牛的雜交母水牛76頭。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集和處理

于水牛頸靜脈采血5mL，4 000r/min離心15min分離血清，-20℃冷凍保存。試驗前將血清樣品和40%的蔗糖（含少許溴酚藍）按1∶1混合。

1.2.2 乳酸脫氫酶分析方法

采用PAGE電泳法，對LDH進行分離[12]。制備7.5%的分離膠和3%的濃縮膠，每個樣品槽上樣量為20μL，150V電壓電泳6h。電泳結束后，取出凝膠，加入染色液，染色至大多數條帶顯現藍紫色時去除染色液，顯色時間一般為15～30min。加入脫色液終止酶促反應，并使凝膠底色脫去至清亮[12]。電泳圖譜經GelDocTM.XR凝膠成像系統照相和掃描，記錄并分析LDH各組分百分比例。

1.2.3 過氧化物酶分析方法

采用PAGE電泳法，對POD進行分離[12]。制備7.5%的分離膠和3%的濃縮膠。每個樣品槽上樣量為25μL，200V電壓電泳5h。電泳結束后，采用醋酸聯苯胺法染色[13]，將取出的凝膠侵入染色液中5～10min，取出凝膠用水漂洗，即停止染色。用GelDocTM.XR凝膠成像系統照相、固定保存。

2 結果與分析

2.1 乳酸脫氫酶多態性分析結果

經電泳分析LDH酶譜，按照各成分泳動的快慢，將出現的5條區帶從正極到負極劃分為LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5（圖1）。在染色過程中最先出現的是LDH1，且顏色最深，表明它的活性最強，其次是LDH2。由圖1可見，德宏水牛和雜交牛血清LDH譜帶，歸納起來共有3種多態型，即3種基因型。Ⅰ型由LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5五種酶組成；Ⅱ型由LDH1、LDH2、LDH3、LDH5四種酶組成；Ⅲ型由LDH1、LDH2、LDH5三種酶組成。德宏水牛有Ⅰ、Ⅱ兩種基因型，其中以Ⅰ型占優勢；雜交牛有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種基因型，其中以Ⅰ型占優勢，其次是Ⅱ型（表1）。

圖1 乳酸脫氫酶電泳圖譜

表1 德宏水牛和雜交牛血清乳酸脫氫酶基因型頻率及組分

用GelDocTM.XR凝膠成像系統對LDH電泳膠進行掃描，結果表明德宏水牛和雜交牛LDH中各成分比例都呈現LDH1＞LDH2＞LDH3＞LDH4＞LDH5的現象（見表2）。其中德宏水牛和雜交牛LDH1百分比分別為47.25%±1.62%和49.27%±0.84%，在LDH同工酶組分中占優勢。德宏水牛LDH3占14.07%±0.49%，顯著高于雜交牛（P＜0.05）。LDH1、LDH2、LDH4、LDH5在德宏水牛和雜交牛中差異性不顯著（P＞0.05）。

2.2 過氧化物酶多態性分析結果

由圖2可見，將德宏水牛和雜交牛POD劃分為兩個區，即一區、二區。根據POD的譜帶，將其分為5種多態型，即5種基因型。按照各成分泳動的快慢，將一區的條帶從負極到正極分為a、b、c三種條帶；二區則分為是否存在條帶。在這5種多態型中，Ⅰ型由一區a、c和二區條帶組成；Ⅱ型由一區a、b、c條帶組成；Ⅲ型由一區a和二區條帶組成；Ⅳ型由一區a、b、c和二區條帶組成；Ⅴ型由一區a、c條帶組成。各種多態型出現頻率如表3，在28個德宏水牛個體中有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四種多態型，其中Ⅲ型出現頻率最高，為42.86%，頻率出現最低的是Ⅳ型；在78個雜交牛水牛個體中有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五種多態型，其中Ⅲ型出現頻率最高，為52.63%，頻率出現最低的是Ⅳ型。由此可以看出，不論是純種牛還是雜交牛均為Ⅲ型出現的頻率最高，是主要表現形式，其次是Ⅰ型。由電泳圖像可以看出雜交牛的多態性高于純種牛。

圖2 過氧化物酶電泳圖譜

表3 德宏水牛和雜交牛血清過氧化物酶基因型頻率及組分

3 討論

LDH催化乳酸脫氫生成丙酮酸及其逆反應，幾乎存在于所有組織中，由M型和H型兩種不同亞基構成五種四聚體，即LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LD，可用聚丙酰胺凝膠電泳法將其分離為5個區帶。根據5條區帶不同的組合可將德宏水牛和雜交牛血清LDH歸納為3種多態型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。德宏水牛和雜交牛LDH以Ⅰ型的居多。根據基因型頻率可知，在28個德宏水牛樣品兩種多態型和76個雜交牛樣品三種多態型中Ⅰ型出現頻率最高，Ⅱ型次之。LDH的條帶雖有部分缺失，但是LDH1、LDH2和LDH5的出現率是100%，而LDH3和LDH4的出現率不是100%，這可能是因為種內存在差異[15]。但是同時表明LDH的多態性，純種牛和雜交牛之間也存在種間差異，雜交牛的多態性高于純種牛。由于LDH由遺傳基因控制，造成德宏水牛LDH差異的原因可能是雜交方式、遺傳因素等。所以可以通過LDH酶譜來研究LDH對遺傳特性、疾病發生原因、臨床治療等方面的作用。欒桂龍等研究了水牛LDH與產奶量的關系，得出產奶量和LDH1、LDH2呈正相關，與LDH3呈負相關[16]。本試驗對各組分含量進行分析，結果LDH1＞LDH2＞LDH3＞LDH4＞LDH5，但德宏水牛和雜交牛血清中各種LDH多態性與生產性能之間的關系尚需進一步研究。

POD是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，主要存在于細胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用[8]。POD具有能使有毒物質失活、調節氧濃度、脂肪酸氧化等功能，還具有抑制病毒活性、抗金屬毒害、緩解機械損傷等作用[17～19]。通過對德宏水牛和雜交牛POD多態性的研究發現，POD共由兩部分區帶組成，根據區帶的不同組合可將德宏水牛的POD分為四種多態型，雜交牛則分為五種多態型，由此可看出雜交水牛多態性高于純種水牛。POD作為一個由單基因控制的同工酶，在很大程度上反映了種、品種間的遺傳差異[20]。雖然由一個基因控制，但表現出多態性，除了有遺傳因子的控制外，還可能有外在的因素控制。由此可以推斷德宏水牛和雜交牛POD同工酶的多態性是由遺傳因子和雜交方式共同作用的結果。

表2 德宏水牛和雜交牛血清乳酸脫氫酶相對含量