培養(yǎng)溫度對(duì)嗜熱鏈球菌抑制法檢測(cè)結(jié)果的影響

張小千，李劼

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003）

牛乳中的抗生素殘留會(huì)嚴(yán)重威脅人體的健康，有關(guān)牛乳中抗生素含量的檢測(cè)已成為食品安全的研究熱點(diǎn)之一[1]。因此，開展牛乳中抗生素殘留快速檢測(cè)方法的研究顯得尤為重要[2]，目前，國(guó)外常用的檢測(cè)方法有生物法、色譜法、免疫分析法、分子印跡技術(shù)[3]等，按照GBT4789.27-2008規(guī)定[4]，嗜熱鏈球菌抑制法（簡(jiǎn)稱TTC法）是我國(guó)鮮牛乳中抗生素殘留檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)推薦方法[5]，其原理是嗜熱鏈球菌在牛奶中生長(zhǎng)會(huì)使無色透明的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）還原為紅色的三苯甲臜[6]，當(dāng)牛奶中抗生素含量超過一定限度時(shí)，會(huì)抑制嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)，使得牛奶中加入的TTC無法被還原，繼而達(dá)到檢測(cè)效果。嗜熱鏈球菌抑制法具有簡(jiǎn)便、靈敏、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，并可以檢測(cè)多種抗生素，目前應(yīng)用廣泛[7]。

嗜熱鏈球菌抑制法中使用的指示菌為嗜熱鏈球菌[8]，根據(jù)GBT4789.27-2008，該方法中菌液在牛奶中的培養(yǎng)溫度為36±1℃[9]。但是在實(shí)際操作中在該溫度下加入指示劑后并不能很好地觀察到檢測(cè)結(jié)果，易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。本試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)牛奶在六種不同的溫度下培養(yǎng)，以確定嗜熱鏈球菌抑制法的最適檢測(cè)溫度，為進(jìn)一步完善國(guó)標(biāo)的檢測(cè)方法、增加嗜熱鏈球菌抑制法的可操作性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

試驗(yàn)所用嗜熱鏈球菌提取自中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 儀器

隔水式恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；高速離心機(jī)，德國(guó)Hettich公司；電熱恒溫水浴鍋，海申生科技有限公司；LX220A電子天平，瑞士普利賽斯公司；HVE-50高壓滅菌器，HIRAYAMA公司；潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.1.3 樣品與試劑

生鮮乳，購(gòu)自石河子大學(xué)某小區(qū)；卡那霉素，成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；2,3,5-三苯基氯化四氮唑，華東師范大學(xué)化工廠產(chǎn)品；蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；葡萄糖，西安化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；磷酸氫二鉀，上海化學(xué)試劑分裝廠產(chǎn)品；吐溫-80，上海化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；西紅柿汁為自制。

1.1.4 培養(yǎng)基

乳酸液體培養(yǎng)基：酵母浸粉7g，蛋白胨7.5g，葡萄糖10g，磷酸氫二鉀2g，10%吐溫-80 0.5mL，西紅柿汁50mL，蒸餾水950mL。

1.2 方法

1.2.1 嗜熱鏈球菌的活化

將在安瓿管中保存的凍干嗜熱鏈球菌用乳酸菌液體培養(yǎng)基洗入試管中，在恒溫箱內(nèi)49±1℃培養(yǎng)24～36h。

1.2.2 嗜熱鏈球菌的增殖

將活化后的嗜熱鏈球菌接種于乳酸固體培養(yǎng)基，放入溫箱，49±1℃培養(yǎng)12～24h。

1.2.3 嗜熱鏈球菌使用液的制備

將乳酸菌固體培養(yǎng)基上的菌落，用無菌水洗入1.5mL EP管中，以5 000r/min離心10min，然后傾掉上清液，稱取重量，EP管中沉淀菌用無菌水洗入試管，再對(duì)EP管稱量，計(jì)算菌重，試管中菌量稀釋為1mg/mL，待用。

1.2.4 溫度對(duì)嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)影響試驗(yàn)

1.2.4.1 平板劃線

將上述稀釋好的菌液振蕩搖勻，用無菌接種環(huán)取一環(huán)劃線培養(yǎng)，在37±1℃、40±1℃、43±1℃、46±1℃、49±1℃、52±1℃下接種兩塊平板，分別于12h、24h后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.4.2 菌落計(jì)數(shù)

將使用液進(jìn)行10倍梯度稀釋，作5個(gè)稀釋度，即1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍的稀釋，然后吸取10-3、10-4、10-5稀釋度的菌液1mL加入平皿中，每個(gè)稀釋度做4個(gè)平皿，2個(gè)1組，共2組，分別于不同的溫度中培養(yǎng)12h和24h，觀察記錄。

1.2.5 溫度對(duì)TTC法檢測(cè)結(jié)果影響試驗(yàn)

1.2.5.1 生鮮乳的處理

將購(gòu)買的新鮮牛奶分為兩份，一份加入卡那霉素（在樣品中含量為5IU/mL）做陽性對(duì)照。將兩份牛奶分別加入試管，每管加入4.5mL，做好標(biāo)記，然后放入恒溫水浴鍋中80℃滅菌20min后從鍋內(nèi)取出，冷卻到37℃以下備用。

1.2.5.2 培養(yǎng)溫度設(shè)置與觀察

取加樣試管，在每管中加入0.5mL使用菌液，置于溫箱，分別在37±1℃、40±1℃、43±1℃、46±1℃、49±1℃、52±1℃下培養(yǎng)，每個(gè)溫度分別培養(yǎng)1h、1.5h、2h后，加入TTC指示劑，每30min觀察一次結(jié)果，共觀察記錄兩次。

2 結(jié)果

2.1 嗜熱鏈球菌劃線平板的生長(zhǎng)情況

嗜熱鏈球菌劃線平板生長(zhǎng)情況見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)溫度、時(shí)間嗜熱鏈球菌劃線平板生長(zhǎng)情況

由圖1可以看出，當(dāng)嗜熱鏈球菌培養(yǎng)溫度為37±1℃、40±1℃時(shí)，培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)數(shù)量略低；培養(yǎng)溫度為43±1℃、46±1℃、49±1℃、52±1℃時(shí)，菌落生長(zhǎng)情況較好；培養(yǎng)溫度在49±1℃時(shí)，菌落生長(zhǎng)情況優(yōu)于其他溫度。

2.2 嗜熱鏈球菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

表1 不同溫度下菌落生長(zhǎng)結(jié)果 單位：cfu

從表1可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度在37℃時(shí)，菌落總數(shù)平均為1.6×102；培養(yǎng)溫度在40℃時(shí)，菌落總數(shù)平均為8.1×102；培養(yǎng)溫度在43℃時(shí)，菌落總數(shù)約為1.7×103；培養(yǎng)溫度在46℃時(shí)，菌落總數(shù)約為2.3×103；培養(yǎng)溫度在49℃，菌落總數(shù)約為3×103；培養(yǎng)溫度在52°C時(shí)，菌落總數(shù)約為2.5×103；可見溫度在49°C時(shí)菌落生長(zhǎng)情況最好，菌落總數(shù)最多。

2.3 不同溫度下TTC法檢測(cè)結(jié)果

表2可以看出，6個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度組中加抗牛奶在各溫度下加入指示劑均未變色；當(dāng)嗜熱鏈球菌培養(yǎng)溫度在37±1℃時(shí)，加入指示劑后都沒有顏色變化，可見在該溫度時(shí)TTC法無法進(jìn)行檢測(cè)；當(dāng)嗜熱鏈球菌培養(yǎng)溫度在40±1℃的時(shí)候，加入指示劑1h后出現(xiàn)顏色變色，但在相同時(shí)間變色程度不佳，TTC法檢測(cè)觀察不明顯；當(dāng)嗜熱鏈球菌培養(yǎng)溫度在43±1℃、46±1℃、52±1℃時(shí)在相同時(shí)間中變色效果較好，且46±1℃＞52±1℃＞43±1℃，但觀察結(jié)果沒有達(dá)到預(yù)期要求；當(dāng)嗜熱鏈球菌培養(yǎng)溫度在49±1℃時(shí)在相同時(shí)間內(nèi)變色效果最好，在培養(yǎng)1.5h后加入指示劑反應(yīng)30min已經(jīng)變?yōu)榧t色，其變色效果達(dá)到預(yù)期要求。

3 討論

TTC法具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、易于開展應(yīng)用等特點(diǎn)，在我國(guó)已廣泛使用。本試驗(yàn)通過在不同溫度下的嗜熱鏈球菌抑制試驗(yàn)，對(duì)嗜熱鏈球菌抑制法做了進(jìn)一步改進(jìn)。TTC法常用于檢測(cè)的抗生素為卡那霉素（最低檢出限為5IU）、青霉素（0.04IU）、鏈霉素（0.5IU）、慶大霉素（0.4IU），由于檢測(cè)卡那霉素的最低檢出限為5IU，在加入牛奶中更有利于攪拌均勻，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，所以本試驗(yàn)選擇卡那霉素作為加抗對(duì)照；同時(shí)，本試驗(yàn)采用稱重法制備嗜熱鏈球菌使用液，與普通稀釋法相比，稱重法操作簡(jiǎn)便，快速，易保持細(xì)菌活性，適于TTC法操作過程中對(duì)指示菌進(jìn)行定量。

表2 TTC法檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)確定在49±1℃時(shí)菌落生長(zhǎng)情況最好，變色效果最佳，有利于觀察檢測(cè)結(jié)果，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，提高了該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)結(jié)果完善了乳品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)促進(jìn)我國(guó)乳品行業(yè)健康發(fā)展起到有益作用。