淫羊藿素通過抑制BACE1阻斷APP-PS1-HEK293細胞中淀粉樣蛋白生成

張 歆，馮 飛，李園園，巴智勝，黃南渠，羅 勇

(1.遵義醫科大學第三附屬醫院 神經內科，貴州 遵義 563002；2.遵義醫科大學第三附屬醫院 藥物臨床試驗機構辦公室，貴州 遵義 563002)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種中樞神經系統退行性疾病，其特征在于老年人的進行性認知功能和行為障礙。根據國際阿爾茨海默病協會2016年度報告顯示，中國約有950萬癡呆患者，到2030年可能超過1 600萬[1]。由于缺乏有效的治療藥物，AD將成為未來中國面臨的主要公共衛生問題。雖然到目前為止尚未充分了解AD的確切病因，但遺傳證據已證明淀粉樣蛋白-β(Amyloid-β，Aβ)是通過β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)順序切割淀粉樣蛋白前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)而產生的，BACE1在AD的發病機制中起關鍵作用[2]。作用于BACE1的抑制劑，可能是有AD潛在風險的人的有效預防策略。

淫羊藿素(Icaritin，ICT)，一種來自傳統補益中藥淫羊藿的異戊二烯類衍生物，分子量為386.4，具有良好的脂溶性，易于通過血腦屏障。研究表明ICT能增強間充質干細胞活力[3]，減弱由Aβ誘導的氧化應激和神經元毒性[4-5]。而天然黃酮類化合物可作為非肽類BACE1抑制劑，有效抑制BACE1活性并降低Aβ的分泌水平。本課題組長期從事ICT治療AD的研究，采用多種AD模型證實ICT對AD的治療作用，發現ICT可改善Aβ25-35海馬注射的大鼠以及SAMP8快速老化小鼠的學習記憶減退，與其激活AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，抑制BACE1有關[6-7]。但ICT與來自的Merck的verubecestat(或MK-8931)和AstraZeneca的AZD3293(或LY3314814)的BACE1的抑制劑不同[8-10]。ICT作為一種生物活性小分子，對APP代謝具有更廣泛的藥理學修飾。為了進一步探索ICT對Aβ生成的調控機制，本實驗主要探討ICT對BACE1的調控及其神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養 APP-PS1-HEK293細胞系購自上海酶聯生物科技有限公司。APP-PS1-HEK293細胞以DMEM/High培養基(Hyclone，SH30022.01B)[含10%胎牛血清(BI，04-001-1A)，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL(Hyclone，SV30010)]于37℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2 主要試劑 ICT(純度>98.3%)購自南京澤朗醫藥科技有限公司；MTT購自合肥新恩源生物技術有限公司；LDH測定試劑盒、DAPI(C1002)購自上海碧云天生物技術有限公司；ECL試劑盒購自賽默飛中國；ELISA測定試劑盒購自R&D中國；BACE1熒光共振能量轉移(FRET)測定試劑盒購自美國Panvera；BACE1(ab2077)抗體，PS1抗體(ab76083)，ADAM10抗體(ab1997)，Aβ1-40抗體(ab20068)，GAPDH抗體(ab8245)和山羊抗兔IgG H&L(DyLight 488)購自Abcam中國；辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗小鼠或抗兔IgG抗體購自上海Abmart。

1.3 主要儀器 電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；BCD-539WT對開門冰箱：中國Haier公司；超凈工作臺：蘇州凈化設備廠；細胞培養板：蘇州海貍生物醫學工程有限公司；XW-80A型漩渦混合器：江蘇海門麒麟醫用儀器廠；蛋白變性儀、Centrifuge 5417 R冷凍離心機、Research plus手動移液器：德國Eppendorf 公司；Multiskan Go 酶標儀、Forma 3131二氧化碳細胞培養箱：美國Thermo Fisher Scientific公司；熒光倒置顯微鏡1X73、光學顯微鏡BX43：日本Olympus公司；-80℃超低溫冰箱立式MDF-382E(CN)、SIM-F124制冰機：日本SANYO公司。

1.4 主要方法

1.4.1 IC50測定 根據制造商的說明書使用BACE1 FRET試劑盒進行BACE1酶抑制試驗。在DMSO中制備化合物的儲備溶液。將樣品在測定緩沖液中進一步稀釋以制備3×濃度的測試化合物。在黑色的96孔微量培養板的不同孔中，將10 μL BACE1底物(3×濃度)加入10 μL 3×濃度的每種測試化合物中并輕輕混合。然后向每個孔中加入10 μL 3× BACE1酶以開始反應。將平板在黑暗中于25 ℃溫育90 min。然后，向每個孔中加入10 μL終止緩沖液(乙酸鈉)以終止反應。最后，分別在545 nm和585 nm的激發和發射波長下進行熒光測量。通過將獲得的每小時相對熒光單位(RFU/h)與抑制劑濃度的對數作圖來計算IC50值。通過非線性回歸(曲線擬合)在GraphPad Prism 7中分析測量的抑制數據。

1.4.2 MTT及LDH檢測細胞活力及毒性 將用96孔板(5000個/孔)培養的APP-PS1-HEK293細胞用0.1～100 μmol/L的ICT處理16 h。除去培養基，向各孔中加入50 μL含MTT(0.5 mg/mL)的DMEM。將細胞在37 ℃下孵育3 h，加入150 μL DMSO進行溶解，在酶標儀上測量570 nm處的吸光度。根據制造商的方案，在細胞處理后，使用LDH測定試劑盒檢測LDH漏出率，在490 nm處測量吸光度。

1.4.3 ELISA測定Aβ1-40用0.5～10 μmol/L的ICT處理APP-PS1-HEK293細胞16 h后，收集培養基和細胞。吸取每瓶細胞的培養基，2 000 r/min離心10 min后取上清用于檢測細胞外Aβ1-40；同時每瓶剩下的細胞需加入RIPA裂解液200 μL及PMSF 2 μL冰上裂解30 min，用細胞刮刮下，于4℃離心機里以10 000 r/min離心15 min，收集的上清液用于檢測細胞內Aβ1-40。ELISA試劑盒實驗步驟均按照試劑盒說明書進行。

1.4.4 免疫熒光測定BACE1 用0.5～10 μmol/L的ICT處理16h后，將蓋在蓋玻片上的細胞在-20 ℃下用甲醇固定20 min，在室溫下用0.1%Triton X-100的PBS處理5 min，用含5%牛血清白蛋白的PBS封閉30 min，然后與BACE1抗體(1∶1 000)在37 ℃溫育2 h。經PBS洗滌后，在37 ℃下與綴合有Dylight 488(1∶1 000)的二抗在黑暗中孵育1 h。然后在室溫下，在暗處將細胞用DAPI進一步染色2 min并洗滌。然后，使用Olympus BX43F熒光顯微鏡進行觀察。

1.4.5 Western blot測定BACE1、PS1、ADAM10和Aβ1-40的表達 如前所述,培養后制備APP-PS1-HEK293細胞裂解物。在4℃裂解緩沖液處理30 min后，通過在12 000 rpm離心30min除去不溶物質，并使用BCA蛋白質測定試劑盒(Generay，GK5012)測定裂解物的蛋白質濃度。然后通過SDS-PAGE(Beyotime，P0012AC)分離等量(10 μg)的每種樣品，轉移至PVDF膜(Merck，IPVH00010)。將膜在5%脫脂牛奶的TBST溶液中封閉1 h，TBST洗滌后，在4 ℃下與抗體孵育過夜：BACE1(1∶1 000)，PS1(1∶1 000)，ADAM10(1∶1 000)，Aβ1-40(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)。

用TBST在10min內洗滌膜3次，并與HRP綴合的山羊抗小鼠或抗兔IgG抗體(1∶5 000)一起在室溫孵育1h。然后，用TBST洗滌膜3次，并使用ECL試劑盒顯現。用Quantity Ones軟件(Bio-Rad)定量條帶的強度。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0對數據進行統計分析。實驗數據以均數±標準誤表示，用ONE-WAY ANOVA分析處理，方差齊用LSD法；方差不齊用Dunnett′T3法，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IC50ICT以濃度依賴性方式抑制BACE1的活性，IC50為5.70±1.09 μmol/L(見圖1)。

ICT對BACE1的IC50，IC50為5.70±1.09 μmol/L(Mean±SEM,n=3)。圖1 用FRET法測定ICT對BACE1活性的影響

2.2 ICT對APP-PS1-HEK293細胞的保護作用 與對照組相比，當ICT濃度為(5～10 μmol/L)時，APP-PS1-HEK293細胞的活力增加(P<0.05)，細胞的LDH漏出率下降(P<0.05)。這些結果表明ICT在濃度為(5～10 μmol/L)時對APP-PS1-HEK293細胞具有保護作用(見圖2)。

A：ICT對細胞活力的影響;B：ICT對LDH泄漏率的影響(*:與對照相比P<0.05,Mean±SEM,n=3)。圖2 ICT在APP-PS1-HEK293細胞中的保護作用

2.3 ICT對APP-PS1-HEK293細胞內和細胞外Aβ1-40的影響 經過處理后，在APP-PS1-HEK293細胞和培養基中，通過ELISA測量Aβ1-40的含量。我們發現細胞內Aβ1-40含量高于細胞外(P<0.05)，并且通過ICT處理，與對照組相比，Aβ1-40含量降低(P<0.05)(見圖3)。

A：Aβ1-40的細胞外濃度;B：細胞內Aβ1-40濃度；*:與對照相比P<0.05,Mean±SEM,n=3。圖3 ICT(0.5、5、10 μmol/L)對APP-PS1-HEK293細胞中細胞外和細胞內Aβ1-40的影響

2.4 ICT對APP-PS1-HEK293細胞中BACE1表達的影響 如圖4所示，藍色熒光為DAPI代表細胞核，綠色熒光為BACE1。隨著ICT濃度的增加，BACE1熒光強度減少，表明ICT對APP-PS1-HEK293細胞中的BACE1表達具有抑制作用。

藍色熒光代表APP-PS1-HEK293細胞的細胞核，綠色熒光代表BACE1(比例尺為20 μm)。圖4 ICT降低APP-PS1-HEK293細胞中BACE1的表達

2.5 ICT對APP-PS1-HEK293細胞中Aβ形成途徑的影響 為了研究Aβ是否真的減少了并且Aβ生成途徑是否參與APP-PS1-HEK293細胞中ICT的保護作用，我們檢測了Aβ1-40和該途徑中涉及的一些蛋白。如圖5所示，相對于對照，ICT處理的APP-PS1-HEK293細胞中Aβ1-40表達明顯減少(P<0.05)，ADAM10表達增加(P<0.05)，BACE1表達降低(P<0.05)，PS1表達降低(P<0.05)。

A：代表性條帶;B：ADAM10的蛋白質水平;C：BACE1的蛋白質水平;D：PS1的蛋白質水平;E：Aβ1-40的蛋白質水平(*:與對照相比P<0.05,Mean±SEM,n = 3)。圖5 ICT對APP-PS1-HEK293細胞Aβ形成途徑相關蛋白的影響

3 討論

中醫藥是我國數千年醫藥實踐的結晶，從傳統中醫藥理論中尋找難治疾病的治療策略極具潛力。傳統中醫理論認為腎與腦關系密切，自古便有“腎主骨生髓，腦為髓之海”的理論。中醫理論認為腦的功能強健與否主要取決于腎中精氣之盈虧[11]。AD為癡呆之癥的主要類型，因此，根據中醫理論，補腎陽的中藥將會是治療AD的新希望。

淫羊藿(EpimediumL.)是貴州省道地中藥材，為小蘗堿科多年生直立草本植物淫羊藿的地上部分，是傳統補益類中藥之一[12]。因此，基于中醫理論可以推斷淫羊藿或其有效成分在治療AD方面具有重要價值[13]。ICT是淫羊藿中提取出的黃酮類有效成分之一，本課題組前期發現ICT可改善Aβ25-35海馬注射的大鼠以及SAMP8快速老化小鼠的學習記憶減退，與其激活AMPK，抑制BACE1有關[6-7]。在本實驗條件下，類似于其它黃酮類化合物如槲皮素和芹菜素[14]，ICT以濃度依賴性方式抑制BACE1的活性，IC50為5.70±1.09 μmol/L。當ICT(5～10 μmol/L)時，APP-PS1-HEK293細胞的活力增加，LDH漏出率下降，表明ICT在該濃度范圍具有保護作用。而與對照組相比，ICT對APP-PS1-HEK293細胞外和細胞內的Aβ1-40均有降低作用。那ICT是如何調控Aβ的呢？

研究表明APP是Aβ的來源，它可被α-分泌酶(ADAM10)、β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶(PS1)分解，其中被BACE1和PS1加工產生Aβ，而被ADAM10加工卻被清除[15]。小檗堿可通過抑制BACE1改善3×Tg-AD小鼠的空間學習和記憶功能[16]。很多化合物(維甲酸、沒食子酸、隱丹參酮、藁本內酯、白果內酯等)可通過ADAM10刺激非淀粉樣蛋白生成途徑，促進APP水解，發揮神經保護作用[17]。在本研究中，ICT(5～10 μmol/L)可降低APP-PS1-HEK293細胞的BACE1和PS1蛋白表達，減少Aβ1-40的生成。與此同時，ICT增加了ADAM10的表達，可能發揮了清除APP的作用。并且，在這3個酶中，BACE1的變化最為明顯。因此，ICT具有抗Aβ生成的作用，其機制可能主要與其抑制BACE1有關。這不僅為ICT用于治療AD奠定基礎，也為淫羊藿的開發提供新的理論依據。