天麻多糖對小鼠骨骼肌衰老作用的實驗研究

王新梅，劉坤祥

(遵義醫科大學 人體解剖學教研室，貴州 遵義 563099)

肌肉衰退和萎縮是衰老的重要標志，人體增齡過程至30歲以后每10年肌纖維數量減少5.8%，50歲以后每10年減少12%，80歲以后每10年減少40%[1]，肌纖維數量的減少和力量的降低引起神經和肌肉的協調及平衡紊亂，使老年人容易跌倒并導致骨折[2]，嚴重威脅老年人的生活質量，探討衰老過程對骨骼肌的影響及其防治具有重要意義。增齡性骨骼肌衰老亦稱骨骼肌減少癥(Sarcopenia)，其特征是肌肉質量、肌肉力量和生理功能在生長過程中逐漸減小和衰退[3]。目前骨骼肌減少癥的治療方法主要包括合理膳食與營養、運動訓練和藥物治療[4-6]。雖然運動訓練療法的防治作用得到醫學界廣泛認同，但由于老年人骨骼肌衰弱程度和安全運動量的差異，個性化治療必不可少。促進蛋白合成的激素類藥物因其副作用而逐漸被摒棄，肌肉生長抑制素抑制劑的價值仍在研究中，抗氧化劑對骨骼肌減少癥的防治效果也備受關注。天麻多糖(Gastrodia elata polysaccharide，GEP)是天麻的主要活性成分，具有抗衰老、改善學習記憶的作用[6-7]，但在衰老過程中其抗骨骼肌減少的作用及機制未見文獻報道。本文擬用D-半乳糖誘導建立衰老小鼠模型，探討GEP對骨骼肌衰老的影響，并初步探討作用機制，為運動醫學的臨床實踐提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級12周齡健康昆明(KM)小鼠50只，雌雄各半，購自重慶醫科大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(渝)：2017-0001]。

1.1.2 主要試劑與材料 天麻多糖粉劑(純度≥90.0%)購自楊凌慈緣生物技術有限公司，常溫保存，使用前用生理鹽水配制；D-半乳糖(北京綠澤森生物技術公司)；GSH-Px、CAT、MDA、SOD及8-OHdG試劑盒(MM，上海酶免)；RIPA、PVDF膜、封閉專用脫脂奶粉、 細胞裂解液(北京普利萊基因有限公司)；Trizon Reagent(CWO580S)、BCA蛋白定量試劑盒(CW0014S)(康為世紀公司)；Caspase-3、MAFbX、MURF-1、GAPDH一抗及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(中杉金橋公司)。

1.1.3 主要儀器 UV-1600PC紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；DYY-6C蛋白垂直電泳儀(北京市六一儀器廠)；倒置熒光顯微鏡(Leica)；TGL-16G低溫高速離心機(常州中捷實驗儀器制造有限公司)；CFX ConnectTM實時熒光PCR儀(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)；HH-2數顯恒溫水浴鍋(鄭州宏朗儀器設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 適應性喂養1周后，隨機分為5組，每組10只(雌雄各半)：對照組(control)、模型組(model)和天麻多糖低(low)、中(medium)、高(high)劑量組。天麻多糖低、中、高劑量組與衰老模型組小鼠每天皮下注射5%D-半乳糖(125 mg/kg)造模，對照組以相同方式注射等體積生理鹽水，連續給藥8周。從造模第10天開始，低、中、高劑量組分別給予0.4、2.0、10.0 mg/(g·d-1)天麻多糖灌胃，連續7周，對照組與衰老模型組以等體積的生理鹽水替代。普通飼料喂養，自由飲水，環境溫度20-24℃，實驗結束頸椎脫臼處死，取材用于后續檢測。

1.2.2 小鼠一般情況觀察 每周觀察小鼠精神、自主活動、毛發色澤及每周末檢測小鼠體重變化；每個月末用握力試驗檢測小鼠肌肉力量：先讓小鼠前肢抓住水平繩子，觀察出現后肢抓繩爬行所需的時間；測算腓腸肌、股四頭肌、肝、腎的臟器系數(臟器系數(%)=臟器濕重/體重)。

1.2.3 肌組織病理學檢測 取0.5 cm×0.5 cm腓腸肌組織4%多聚甲醛固定6 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，作3～5 μm橫切片，HE染色，高倍鏡下觀察拍照，每張切片選取5個視野，Image Pro Plus 5.0軟件測量肌纖維橫截面積。

1.2.4 ELISA檢測氧化應激相關指標 稱取40 mg腓腸肌組織充分勻漿，2 000 rpm離心20 min，收集上清液，按ELISA 檢測試劑盒說明書操作流程，450 nm波長測定吸光度值，以標準物濃度與OD值繪制標準曲線，檢測計算腓腸肌組織SOD、CAT、GSH-Px、MDA及8-OHdG含量。

1.2.5 qRT-PCR檢測Caspase-3、MAFbX、MuRF-1的mRNA表達 取腓腸肌組織，液氮研磨，13 400 rpm離心20 min后取上清，加入Trizol試劑提取總RNA，以OD260/280確定RNA純度，按試劑盒說明逆轉錄成cDNA，Real-time PCR擴增Caspase-3、MAFbX、MURF-1和GAPDH基因。反應體系50μL，反應條件：95 ℃ 5 min 、95 ℃ 30 s 、59 ℃ 30 s 、72 ℃ 30 s、40個循環，用2-ΔΔCt計算各基因的mRNA相對表達量，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成，序列(見表1)。

表1引物序列

基因引物序列(5′-3′)擴增長度(bp)MuRF-1上游GTGCCAACGACATCTTCCAG158下游TTCCACCAGCAGGTTCCTCTMAFbX上游CAGCAGCCTGAACTACGACG174下游GAGAAGTCCAGTCTGTTGAAAGCCaspase-3上游TGGACGCAGCCAACCTCAGAG382下游GCATACAGGAAGTCAGCCTCGAPDH 上游AAGAAGGTGGTGAAGCAGG111下游GAAGGTGGAAGAGTGGGAGT

1.2.6 Western blot檢測Caspase-3、MAFbX、MuRF-1mRNA蛋白水平 提取0.2g腓腸肌組織的總蛋白，按BCA法進行蛋白定量。上樣進行凝膠電泳，轉膜，用3%脫脂奶粉室溫封閉，加入1抗稀釋液，孵育3 h，洗膜3次后加入2抗稀釋液(1∶5 000稀釋)，孵育2 h，洗滌，ECL試劑顯影，應用軟件分析蛋白質條帶的灰度值，以目的蛋白與內參照GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對水平。

2 結果

2.1 一般情況變化 與對照組相比，模型組小鼠出現明顯脫毛現象，毛發色澤變黃，活動度明顯下降，天麻多糖干預的各組小鼠上述情況有明顯改善。與模型組相比，天麻多糖干預的各組小鼠體重增加明顯，且呈劑量依賴性(見圖1)。

圖1 各組小鼠體重變化

2.2 肌力、臟器系數及肌組織病理變化 與對照組相比，模型組小鼠1個月末和2個月末后肢開始抓繩爬行的時間明顯延長，但隨著天麻多糖灌胃給藥，小鼠抓繩攀爬的時間縮短，高劑量組小鼠肌力接近0 month時水平(見圖2)；天麻多糖有助于維持恒定的臟器系數，延緩衰老(見圖3)。與對照組相比，模型組的肌纖維橫截面積明顯縮小，而給予低、中、高劑量天麻多糖后，肌纖維橫截面積增加至接近對照組水平(見圖4)。

**：與0 MONTH比較，P<0.01。圖2 各組小鼠四肢肌力的變化

*：與對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。圖3 各組小鼠的臟器系數變化

A：對照組；B：模型組；C：GEP低劑量組；D：GEP中劑量組；E：GEP高劑量組；* ：與對照組比較，P<0.05；#：與衰老模型組比較，P<0.05。圖4 各組小鼠腓腸肌橫截面積變化(×400)

2.3 GEP對小鼠氧化應激水平的影響 與對照組相比，模型組出現SOD、CAT、GSH-Px降低而MDA、8-OHdG增加，表明本實驗成功構建了小鼠衰老模型，而GEP干預的各組顯示上述指標變化出現反轉，差異有統計學意義(見圖5)，體現出GEP具有延緩小鼠骨骼肌衰老的作用。

*：與對照組比較， P<0.05；#：與衰老模型組比較，P<0.05。圖5 腓腸肌SOD、CAT、GSH-Px、MDA、8-OHdG活性及含量

2.4 骨骼肌Caspase-3、MAFbx和MuRF-1 mRNA表達變化 與對照組相比，模型組Caspase-3、MAFbX和MuRF-1的mRNA相對表達量顯著升高。隨著GEP劑量的增加，Caspase-3、mMAFbX和MuRF-1的mRNA相對表達量逐漸下降至接近對照組水平(見圖6)。

與對照組相比，*：P<0.05；與模型組相比,#：P<0.05。圖6 腓腸肌Caspase-3、MAFbX和MuRF-1 mRNA表達

2.5 骨骼肌 Caspase-3、MAFbX和MuRF-1蛋白水平變化 與對照組相比，模型組Caspase-3、MAFbX和MuRF-1蛋白水平顯著上調。隨著GEP劑量的增加，上述Caspase-3、MAFbX和MuRF-1蛋白水平逐漸下降(見圖7)。

*：與對照組比較，P<0.01；#：與模型組比較，P<0.01。圖7 腓腸肌MuRF-1、MAFbX和Caspase-3蛋白水平

3 討論

衰老是增齡過程中出現的全身器官功能退變，而骨骼肌減少是衰老過程在骨骼肌組織的具體體現，其發病率高且嚴重影響老年人的日常活動和生活質量。衰老的自由基學說認為衰老過程中的退行性變化是由于細胞正常代謝過程中產生的自由基的有害作用造成的，而天麻多糖具有抗衰老、清除氧自由基等生物學作用。因此本研究旨在探討天麻多糖對骨骼肌衰老的作用及機制初探。由于增齡性衰老過程的時程較長，本研究選擇目前國內外普遍采用的D-半乳糖誘導建立衰老動物模型，具有接近自然衰老過程且經濟、耗時短、安全的特點。本實驗經皮下注射5%D-半乳糖(125mg/kg)造模8周，模型組小鼠出現明顯四肢肌肉力量下降，HE染色骨骼肌纖維橫截面積明顯減小及氧化應激指標的改變提示已成功建立D-半乳糖誘導骨骼肌衰老小鼠模型。

已有研究結果報道體重、肌肉力量及臟器系數可間接反映機體的衰老程度，而氧化應激與衰老也存在密不可分的關系，SOD和MDA在活性氧代謝中發生主要作用[8]。本研究發現，模型組SOD活性及GSH-Px、 CAT水平較對照組明顯下降，而MDA含量、8-OHdG明顯升高。給予天麻多糖干預可以反轉上述指標變化，同時小鼠的體重、肌肉力量及臟器系數較模型組有明顯改善。進一步證實骨骼肌衰老過程存在氧化應激增強，并由此導致骨骼肌的損傷，并提示天麻多糖可降低骨骼肌衰老過程中的氧化應激及其對骨骼肌損傷，進而延緩其衰老。

骨骼肌是人體的蛋白質庫，衰老過程中的骨骼肌減少實質是蛋白質合成和降解的失衡，導致肌肉功能減退[9-10]。泛素蛋白酶系統是骨骼肌蛋白質降解過程中的主要途徑，泛素連接酶(E3)是該途徑的關鍵酶。泛素連接酶(E3)中的肌肉環指蛋白-1(MuRF-1)和肌肉降解因子(MAFbX)，是泛素蛋白酶系統在肌肉降解中的重要組成部分[11-12]。另一方面骨骼肌萎縮與細胞凋亡密切相關，骨骼肌是一種富含線粒體的組織，產生的氧自由基(ROS)可直接損傷DNA并誘導細胞凋亡，Caspase家族相關蛋白的激活是引起凋亡的直接效應物[13-14]，Caspase-3是細胞凋亡的執行者。故本研究選擇從骨骼肌蛋白降解途徑的關鍵酶((MuRF-1、MAFbX)和肌細胞凋亡途徑相關因子(Caspase-3)為對象，進一步探討天麻多糖延緩骨骼肌衰老可能機制。結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠腓腸肌MAFbX、MuRF-1及Caspase-3的mRNA表達和蛋白水平上調；給予天麻多糖干預后， MAFbX、MuRF-1及Caspase-3的mRNA表達和蛋白水平逐步恢復。由此推測，天麻多糖對骨骼肌細胞凋亡途徑及泛素蛋白酶途徑有一定的調控作用。

綜上所述，D-半乳糖可誘導小鼠產生衰老模型，天麻多糖干預可緩解此模型的小鼠骨骼肌衰老，其作用機制可能與下調氧化應激水平、抑制細胞凋亡和抑制泛素蛋白酶系統有關。