慢性萎縮性胃炎胃黏膜Runx3基因及蛋白表達與幽門螺桿菌感染的關系研究

夏 韜，丁西平，朱 敏，王 衛

(1.安徽醫科大學附屬省立醫院消化內科，合肥 230001；2.安徽省廬江縣人民醫院消化內科 231500)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類的健康。近年來，隨著人們良好飲食習慣的形成及幽門螺桿菌(Hp)的根除，胃癌的發病率有所下降，但發病率及病死率仍高居全球前列[1-2]。據2015年中國癌癥數據報告，我國胃癌的發病率和病死率在惡性腫瘤中均高居第2位[3]。胃癌發生受多種因素影響，并且是一個多階段的逐步發展過程。在慢性萎縮性胃炎(CAG)的基礎上發生的腸上皮化生和不典型增生等變化被稱為胃癌前病變，其是否進一步發展為胃癌還受Hp感染、環境和遺傳等多因素的影響[4-5]。Runx3基因作為目前公認的抑癌基因，近年來研究認為其甲基化與胃癌及CAG密切相關[6]。因此，通過研究CAG患者胃黏膜中Runx3基因表達與Hp感染的關系，對了解二者在CAG中的相互影響具有重要意義。本研究使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)及免疫蛋白印跡法(Western blot)分析了CAG患者根除Hp前后胃黏膜中Runx3基因及蛋白表達的變化，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年6月于廬江縣人民醫院及安徽省立醫院經胃鏡檢查及病理證實的CAG患者80例作為研究對象。納入標準：(1)年齡大于或等于18歲；(2)首次診斷患者；(3)經胃鏡及病理證實為中、重度CAG；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)自身免疫性胃炎、胃食管反流病、消化道潰瘍及消化道出血等消化道其他良性病變患者；(2)消化道惡性腫瘤患者；(3)近期(3個月)內服用葉酸、維生素B12的患者；(4)有胃部手術史的患者；(5)伴有嚴重心腦血管病、全身感染性疾病及臟器衰竭的患者；(6)妊娠期、 哺乳期或準備受孕的婦女；(7)不愿按要求完成研究或有精神病的患者。本研究經安徽省立醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。根據Hp感染情況，將53例Hp陽性患者作為觀察組，將27例Hp陰性患者作為對照組。兩組間性別、年齡、體質量指數(BMI)、吸煙及飲酒比例等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

1.2儀器與試劑 主要儀器：凝膠圖像分析儀(珠海黑馬醫學儀器有限公司)，Tprofessional Thermocycler PCR儀(美國Biometra公司)，實時定量PCR儀(美國ABI公司)，紫外分光光度計(日本日立公司)，低溫高速離心機、電子天平、移液器(德國Eppendorf公司)。主要試劑：組織基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、Wizard DNA Clean-Up System試劑(美國Promega公司)、PCR引物(大連寶生物工程有限公司)、甲基化酶 SssI(美國New England Biolabs公司)，Taq plus PCR Master-Mix、SYBR Green Ⅰ Mastex、Runx3小鼠抗人單抗(美國Santa Cruz公司)，羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3試驗方法 (1)胃鏡檢查：納入者均由固定的內鏡醫師行胃黏膜取材，根據病變部位選取胃黏膜進行活檢病理檢查及液氮保存。病理檢查由兩名病理科醫師進行讀片確定。(2)診斷：CAG的診斷參照《中國慢性胃炎共識意見》[4]，包括內鏡診斷和病理診斷；確診以病理診斷為依據。(3)Hp檢驗：采用國際公認的金標準C13尿素呼氣試驗。(4)Hp根治：參照《第4次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》[7]推薦方案，根治2個月后復查C13尿素呼氣試驗。(5)Runx3基因甲基化檢測：對提取DNA進行亞硫酸氫鈉修飾和純化，然后進行甲基化特異性PCR(MSP)及電泳分析。(6)Runx3基因mRNA的表達：提取胃鏡所取胃黏膜組織mRNA，反轉錄合成cDNA；設標準品校正和去離子水(ddH2O)代替DNA模板的陰性對照，每份樣品均同時做2個平行復孔進行qPCR。以β-actin為內參，并對所有樣品進行均一化處理。(7)Runx3蛋白表達的測定：提取總蛋白后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，Runx3檢測條帶44×103，內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)條帶36×103。Image J軟件分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值。

2 結 果

2.1Hp感染對中、重度CAG患者胃黏膜Runx3基因甲基化的影響 MSP法檢測CAG患者胃黏膜Runx3基因甲基化情況，見圖1。對照組中8例患者胃黏膜Runx3基因甲基化，陽性率為29.6%(8/27)；觀察組中28例患者胃黏膜Runx3基因甲基化，陽性率為52.8%(28/53)。兩組Runx3基因甲基化陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=3.890，P=0.049)。

表1 兩組一般資料比較

MA：標記物;MP：甲基化陽性對照；UP：非甲基化陽性對照；C：空白對照；1：觀察組重度CAG患者胃黏膜標本；2：對照組中度CAG患者胃黏膜標本；3：觀察組中度CAG患者胃黏膜標本；4：對照組重度CAG患者胃黏膜標本

圖1 MSP法檢測CAG患者胃黏膜Runx3基因甲基化

2.2Hp感染對中、重度CAG患者胃黏膜Runx3基因mRNA和蛋白表達的影響 觀察組患者胃黏膜Runx3 mRNA表達水平低于對照組，差異無統計學意義(t=1.233，P=0.221)。亞組分析顯示，觀察組中度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA表達水平低于對照組中度CAG患者，差異無統計學意義(t=0.552，P=0.583)；觀察組重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA表達水平低于對照組重度CAG患者，差異有統計學意義(t=2.226，P=0.036)，見表2。觀察組CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達水平低于對照組，差異有統計學意義(t=2.143，P=0.035)，見圖2。亞組分析顯示，觀察組中度CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達水平低于Hp陰性的對照組中度CAG患者，差異無統計學意義(t=1.468，P=0.148)；觀察組重度CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達水平低于對照組重度CAG患者，差異有統計學意義(t=2.240，P=0.035)，見表2。

表2 兩組Runx3 mRNA及蛋白表達水平比較

*：P<0.05，與對照組比較

2.3根除Hp對中、重度CAG患者胃黏膜Runx3基因甲基化、mRNA及蛋白表達的影響 根除Hp治療后2個月復查，觀察組53例CAG患者中44例轉陰，9例仍為陽性(中度CAG患者6例、重度CAG患者3例)。觀察組中44例Hp轉陰CAG患者根除Hp前有22例Runx3基因甲基化陽性，根除后6例轉為陰性。與根除前比較，根除Hp后中重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA表達水平升高，差異有統計學意義(t=-3.249，P=0.002)；亞組分析顯示，與根除前比較，根除Hp后中度及重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA表達水平升高，差異均有統計學意義(t=-2.460、-2.534，P=0.020、0.028)，見表3。與根除前比較，根除Hp后中重度CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(t=-3.166，P=0.003)，見圖3；亞組分析顯示，與根除前比較，中度及重度CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(t=-2.164、-2.724，P=0.038、0.020)，見表3。

表3 CAG轉陰患者根除Hp前后Runx3 mRNA及蛋白表達水平比較

*：P<0.05，與根除前比較

圖2 Western blot檢測Runx3蛋白在對照組及觀察組CAG患者胃黏膜組織中的表達

圖3 Western blot檢測Runx3蛋白在中重度患者根治前后胃黏膜組織中的表達

3 討 論

現代醫學觀點認為，臨床多數疾病的發生是由遺傳因素和環境因素共同作用的結果[8]。如胃癌的發生、發展與遺傳學、表觀遺傳學、Hp感染及飲食習慣的相關性已得到學術界的公認，而且基因多態性及表觀遺傳學與Hp感染的交互作用研究已有報道[9-10]。JIA等[11]研究顯示，Hp感染所致胃黏膜的慢性炎癥可增加患者的遺傳基因易感性，能夠導致胃黏膜抑癌基因的異常甲基化，在促進胃癌的發生過程中具有重要作用。HONG等[12]報道，Hp感染可通過在胃癌前病變中的炎性反應和低胃酸環境，使伴有白細胞介素-1β(IL-1β)基因多態性的患者更易發生胃癌。CAG的發生、發展亦是基因與環境共同及相互作用的結果。不良環境和不健康飲食習慣的暴露可通過多種途徑影響抑癌基因的表達，包括自身基因多態性及表觀遺傳學的改變，進而共同促進CAG及胃癌的發生、發展。慢性胃炎特別是CAG的發生、發展過程受多種因素影響，反復或持續Hp感染、不良飲食習慣等均為促進及加重胃黏膜萎縮和腸化生的潛在因素,可導致CAG的患病風險增高并增加癌變的可能[13-15]。

Runx3基因為Runx家族的重要成員之一，目前研究表明Runx3啟動子區CpG島的異常甲基化可直接導致基因靜默和表達缺失引起基因和蛋白表達的降低，進而導致其抑癌作用的失活[16-17]。近年有研究發現，Runx3基因的抑癌作用源于它是轉換生長因子-β(TGF-β)信號轉導通路中的轉錄因子，在Runx蛋白的參與下，通過Smad復合物與靶位點的結合，TGF-β/Smad復合物才能從細胞質轉入細胞核內的功能靶點，發揮調控細胞生長發育、凋亡和惡性轉化等作用[18]。Runx3基因內含2個高度保守的CpG島，其甲基化水平可影響基因表達；當Runx3 表達失活時，影響TGF-β信號通路的轉導，可以參與胃癌等多種疾病的發生[19-21]。CAG為胃癌的癌前病變，了解胃癌的多個相關因素，如Hp及Runx基因在CAG中的相互作用具有一定的臨床意義。黃唯等[22]的研究已證實，CAG患者存在Runx3基因的表達下調，且Runx3基因表達水平降低與CAG及胃癌的發生、發展存在一定的相關性。

有研究認為，Runx3 mRNA及蛋白的表達與CAG的嚴重程度有關，而甲基化可能是導致Runx3蛋白表達下調的主要原因[23-24]。DNA甲基化主要發生在富含CpG島的啟動子區域，通過該區域的甲基化將直接阻礙轉錄因子與啟動子結合，從而使基因不能轉錄或轉錄水平降低[25]。因此，重度CAG患者胃黏膜Runx3基因及蛋白表達下降可能與CAG患者Runx3基因高甲基化影響mRNA的表達有關。CHOI等[26]研究提示，胃癌伴Hp感染患者胃黏膜Runx3基因的表達水平低于Hp陰性者，考慮與Hp感染可能誘使Runx3基因甲基化，從而導致抑癌基因Runx3失活，下調Runx3基因的表達。本研究顯示，觀察組患者胃黏膜Runx3 mRNA及蛋白表達水平低于對照組；亞組分析提示，觀察組中度CAG患者胃黏膜Runx3蛋白表達水平低于對照組中度CAG患者，而mRNA的表達水平在觀察組與對照組中度CAG患者間無明顯差異；觀察組重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA及蛋白表達水平均低于對照組重度CAG患者，與黃唯等[22]研究結果相似。提示CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA及蛋白的表達不但與CAG的嚴重程度相關，而且與Hp感染密切相關；尤其在重度CAG伴Hp感染患者中，胃黏膜Runx3 mRNA及蛋白的表達下降明顯。研究結果顯示，觀察組患者Runx3基因甲基化率高于對照組，因此在CAG伴Hp感染患者尤其是重度CAG伴Hp感染患者中，Hp感染可能在原有Runx3基因甲基化基礎上誘導甲基化進一步加重，引起抑癌基因Runx3失活，導致Runx3基因及蛋白表達的下調。Runx3基因及蛋白低表達和Hp感染在胃癌發生、發展過程中有協同作用；因此，在Hp感染的CAG患者中應予以積極根除Hp治療。

本研究顯示，在CAG伴Hp感染患者尤其是重度CAG伴Hp感染患者中，Hp感染可能誘導甲基化進一步加重，導致抑癌基因Runx3 mRNA及蛋白表達均明顯下降。根除Hp治療后2個月，中、重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA及蛋白表達水平明顯升高；亞組分析顯示，中度及重度CAG患者胃黏膜Runx3 mRNA表達水平均升高；且根除Hp治療后部分CAG患者Runx3基因甲基化陽性轉為陰性。研究結果進一步證實Hp感染可能通過誘導甲基化引起抑癌基因Runx3失活，導致Runx3基因及蛋白低表達；而在根除Hp后，可逆轉Hp感染所致的抑癌基因Runx3 mRNA及蛋白表達下降。因此，在對Hp感染的CAG患者應積極予以根除Hp治療，可以消除Hp在CAG發展中作用及激活抑癌基因Runx3的抑癌作用，其具體調節機制有待于進一步研究。