丹參酮ⅡA通過抑制STAT3活化調控胃癌細胞增殖和凋亡的研究

張擁軍，彭伯堅，曹天生，盧秀珊，郭曙光

(1.廣東省廣州市花都區人民醫院消化內科 510800；2.廣東省廣州市花都區人民醫院普外科 510800；3.中山大學附屬第三醫院體檢科，廣州 510630)

胃癌是世界上發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一[1-2]。據不完全統計,每年新發病例約有100萬例[3-4]。盡管目前胃癌治療取得了一定的進展，但晚期胃癌患者的總體療效不太理想，5年生存率僅為5%～20%[5-6]。近年來，眾多的研究表明傳統中草藥具有顯著的抗腫瘤活性[7-9]。丹參酮ⅡA(TanⅡA)是天然植物丹參的主要活性成分，前期的研究已發現它具有多種藥理活性，比如緩解心絞痛，有效改善血流動力學等[10-12]。近年來，丹參酮ⅡA在乳腺癌、膀胱癌、結直腸癌和前列腺癌中的抗腫瘤活性也廣受研究者青睞[13-14]。雖然有研究表明TanⅡA能抑制胃癌細胞生長，但其潛在的分子機制尚不清楚[15-16]。

信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)是信號轉導因子STAT家族的成員之一[17]。它廣泛參與調節了一系列生物過程,如細胞增殖、腫瘤發生、血管生成和表皮細胞向間充質細胞轉化等[18]。磷酸化STAT3分子上的2個磷酸化位點酪氨酸705(Tyr705)和絲氨酸727(Ser727)對于STAT3組成性激活以及腫瘤的發生、發展發揮著關鍵作用[19-21]。有研究表明STAT3 的構成性激活可以促進胃癌的進一步惡化和發展[22-23]。因此，以STAT3為靶點，發掘新的能抑制STAT3組成性激活的化合物對于治療人類胃癌具有重要的臨床意義。本研究中采用人胃癌細胞株，并給予TanⅡA處理，探討TanⅡA對胃癌細胞增殖的影響，并明確其作用機制是否與抑制STAT3活化有關。

1 材料與方法

1.1細胞培養及試劑 人胃癌細胞株(SNU-638、MKN1和AGS)購自國家細胞資源中心(中國科學院，上海)。SNU-638和MKN1細胞培養于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，AGS細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，并置于含5%CO2的恒溫培養箱。TanⅡA購自Sigma-Aldrich公司。cleaved caspase-3、Bcl和Bax抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，p-STAT3和STAT3抗體購自Cell Signaling Technology公司。FLAG-STAT3和phRL-TK質粒購自生工公司。

1.2四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞增殖 將細胞以1×104個細胞/孔接種于 96 孔培養板中過夜。隨后給予不同濃度的TanⅡA處理不同時間后，每孔加入20 μL MTT染料繼續孵育2 h。小心移除培養基并加入溶解/終止溶液。使用酶標儀在570 nm處檢測各孔吸光度并計算細胞存活率。

1.3細胞凋亡檢測 當不同濃度的TanⅡA處理細胞后，收集細胞至離心管中，離心棄培養液，用PBS洗滌。隨后使用Annexin V和PI雙染色，應用流式細胞儀分析結果。根據比例計算不同藥物濃度對細胞凋亡的影響。

1.4Western blot 當用不同濃度的TanⅡA處理細胞后，加入裂解緩沖液裂解細胞并收集、提取總蛋白進行定量。隨后采用SDS-PAGE分離，PVDF膜電轉，脫脂牛奶(5 %)封閉1 h,分別加入一抗孵育4 ℃過夜。次日加入TBST緩沖液洗膜3次后加入辣根過氧化酶標記二抗，室溫搖床孵育1 h后用TBST緩沖液洗膜3次。最后采用ECL法顯影,并進行定量分析。

1.5細胞轉染和STAT3轉錄活性 根據Lipofectamine 2000使用說明書，將 FLAG-STAT3質粒和對照質粒phRL-TK分別瞬時轉染細胞后，并給予指定濃度的TanⅡA處理。隨后用雙熒光素酶報告基因測定系統測定STAT3的轉錄活性。

2 結 果

2.1TanⅡA抑制人胃癌細胞增殖 MTT實驗結果顯示TanⅡA能以時間和劑量依賴的方式有效抑制SNU-638細胞增殖(圖1A和1B)。10 μg/ mL Tan ⅡA表現出最強抗腫瘤活性，因此被用于后續研究。與此同時，當給予不同濃度TanⅡA處理人胃癌MKN1和AGS細胞之后， TanⅡA也能明顯抑制細胞增殖(圖1C和1D)，但以SNU-638細胞活性最佳，因此SNU-638細胞被選擇用于進一步研究。

2.2TanⅡA誘導人胃癌細胞凋亡 當Annexin-V/PI 雙染色標記TanⅡA處理SNU-638細胞后，使用流式細胞儀檢測TanⅡA對胃癌細胞凋亡的影響。圖2A，2B顯示，TanⅡA處理之后能明顯增加凋亡細胞比例，百分比由7.77%±2.24%(對照組)增加到TanⅡA處理組13.80%±4.06%(2.5 μg/mL)，22.70%±4.25%(5 μg/mL)和32.87%±6.80%(10 μg/mL)。圖2C顯示TanⅡA處理之后能誘導Bax和cleaved caspase-3的蛋白表達，并抑制Bcl蛋白水平。

A:TanⅡA對3種胃癌細胞增殖的時效、量效關系；B:TanⅡA對SUN-638細胞增殖的影響；C：TanⅡA對MKN1細胞增殖的影響；D:TanⅡA對AGS細胞增殖的影響

圖1 TanⅡA對人胃癌細胞增殖的影響

A:Annexin V、PI雙染色細胞凋亡圖；B:相對細胞凋亡率；C：Western blot蛋白條帶及相對蛋白表達

圖2 TanⅡA對胃癌細胞凋亡的影響

A:TanⅡA對STAT3磷酸化的影響；B:TanⅡA對STAT3轉錄活性的影響；C:過表達STAT3對細胞增殖的影響；D:過表達STAT3對細胞凋亡的影響

圖3 TanⅡA對STAT3信號通路的影響

2.3STAT3在TanⅡA抑制人胃癌細胞增殖中的作用 如圖3A所示， TanⅡA(5,10 μg/mL)處理SNU-638細胞能有效抑制STAT3中Tyr705位點的磷酸化水平(約54%和77%)。為了進一步證實STAT3信號通路是否參與了TanⅡA抗胃癌細胞增殖過程，本研究采用了SNU-638細胞與p-STAT-LUC質粒共轉染。雙熒光素報告實驗顯示TanⅡA(5,10 μg/ mL)處理后能有效降低STAT3的活性(圖3B)。STAT3過表達后能顯著減少TanⅡA抑制細胞增殖和誘導凋亡的比例(圖3C和D)。

3 討 論

本研究發現了中藥丹參分離得到的生物活性組分TanⅡA能有效抑制人胃癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，具體機制是由于 TanⅡA 作用于STAT3的磷酸化Tyr705位點從而抑制STAT3磷酸化水平，STAT3質粒共轉染實驗進一步證實了推斷。本研究結果表明TanⅡA能有效抑制STAT3活化過程，從而發揮抗胃癌作用。

胃癌是常見惡性腫瘤,其病死率居全球第三[24]。近年來盡管在胃癌的診斷和治療方面取得了較大進展，但胃癌患者的總體預后仍然較差[25-26]。目前的治療方式能夠在一定程度上控制病情,延長患者生存期,但嚴重的毒副作用不僅會影響復發患者的生活質量,甚至還會危及患者的生命[27]。因此，研發用于胃癌治療的新藥物具有重要的臨床意義。

TanⅡA是從丹參根莖提取的活性成分，大量證據表明TanⅡA對多種癌細胞的生長具有抑制作用[28]。本研究發現TanⅡA處理之后可明顯誘導細胞凋亡，增加Bax和cleaved caspase-3的蛋白表達并下調Bcl蛋白水平。前期研究報道STAT3信號通路的組成性活化被認為是癌癥發生、發展和進展的重要因素[20,29]。本研究發現TanⅡA處理后可明顯抑制體內STAT3磷酸化過程，而且表現出劑量依賴性。當細胞中過表達STAT3時，TanⅡA對細胞增殖的抑制比例以及誘導SNU-638細胞凋亡顯著減少。本研究闡明了STAT3在TanⅡA調控胃癌細胞增殖和凋亡過程中的作用。但是，TanⅡA在體內是否發揮抗胃癌活性，TanⅡA如何影響體內胃癌腫瘤組織中凋亡相關蛋白表達，以及STAT3如何參與調控值得進一步探討。不僅如此，TanⅡA通過其他機制起作用的可能性不能排除，值得深入研究。而本研究仍存在一些局限，比如應該同時納入正常的胃細胞進行比較分析，從而進一步闡述TanⅡA的作用是癌癥特異性的。綜上所述，本研究認為TanⅡA可能通過下調STAT3活化水平從而發揮抗胃癌活性。