健康老年人、老年急性腦梗死患者外周血Th17比例及IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL水平變化

付瑞，丁紹威，劉夢蝶，胡偉，黃開泉，胡超杰，李慶

(1安徽醫科大學附屬省立醫院，合肥230001；2安徽中醫藥大學第一附屬醫院)

急性腦梗死(ACI)是一類危害性較高的神經系統疾病。動脈粥樣硬化(AS)是血栓性腦梗死發生的主要原因之一[1]。由于群體的特殊性，老年人更容易突發ACI[2]。老年人身體存在一系列衰老改變，包括內分泌環境及免疫系統等的衰老改變。由于血管內皮細胞的衰老，調控血管平滑肌收縮和舒張的因子表達水平發生變化，進而影響了血管內環境平衡，最終導致血栓形成[3]。輔助性T細胞17(Th17)是2007年新發現的一類不同于Th1、Th2的CD4+輔助性T細胞，其可分泌多種細胞因子，其中白細胞介素17(IL-17)是Th17的主要效應因子，IL-17在炎癥反應、自身免疫性疾病等的發病中發揮重要作用[4，5]。目前對Th17在衰老和ACI發生中的作用尚未完全闡明。本研究觀察了健康老年人、老年ACI患者外周血Th17比例及血清IL-17、血管黏附分子1(VCAM-1)、血管內皮細胞衰老指標內皮素1(ET-1)、炎癥標志物氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)水平的變化，分析Th17比例及IL-17與VCAM-1、ET-1、ox-LDL的相關性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年5月～2018年4月在安徽省立醫院神經內科住院的老年ACI[6]患者33例(老年腦梗組)，男17例、女16例，均為初診ACI患者。選取同期在院進行體檢的不同年齡段健康人為對照，排除有心腦血管意外病史者，參照WHO推薦標準，青年(44歲以下)28人(健康青年組)、中年(45～60歲)29人(健康中年組)、老年(60歲以上)32人(健康老年組)[7]。各組性別比例差異無統計學意義。健康老年組空腹血糖、TG、LDL水平高于健康青年組和健康中年組，而老年腦梗組高于健康老年組(P均<0.05)。見表1。所有研究對象排除腫瘤、感染、全身免疫性疾病、嚴重肝腎疾病、血液系統疾病，未服用免疫抑制劑和非甾體類抗炎藥。本研究經醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

表1 各組年齡、性別、血糖、血脂指標比較

注：與各組健康人群比較，★P<0.05；與健康老年組比較，△P<0.05。

1.2 外周血Th17檢測 抽取各組5 mL全血用生理鹽水稀釋一倍后緩慢加到淋巴細胞分離液上層，550 r/min 4 ℃離心20 min，棄去上清，小心吸取中層細胞獲得單個核細胞。再經PBS洗滌細胞2次后，加RPMI-1640完全培養基重懸細胞，計數后以2×106/mL接種到24孔板，每孔1 mL。加入混合型細胞刺激劑cocktail 2 μL，并用加樣槍充分混勻細胞懸液，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中無菌培養4～6 h后將細胞收集到試管中，加PBS洗滌后1 200 r/min離心5 min，留取約100 μL液體。向管中加入FITC-CD4 5 μL，用渦旋震蕩器震蕩混勻，4 ℃避光孵育30 min；再在每管中加入適量PBS，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液后加入細胞固定劑100 μL，震蕩混勻后，4 ℃避光反應15 min；加入PBS，1 200 r/min離心5 min洗滌；棄上清，向每管加入100 μL細胞破膜劑，4 ℃避光反應5～10 min，向檢測管中加入PE-IL17A 5 μL，對照管中則加相應的同型對照PE 5 μL，混勻，4 ℃避光孵育15～20 min；再次用PBS以1 200 r/min離心5 min洗滌，加500 μL的PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測。檢測調整流式細胞儀后，對淋巴細胞群進行設門，在淋巴細胞群中再對CD4+T淋巴細胞設門。每份標本獲取設門內細胞數達到10 000個，使用Diva Software V6.1.3進行數據分析。

1.3 血清IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL檢測 將抽取的全血放入非抗凝生化管，室溫靜置2 h待血清充分析出后以低速離心機3 000 r/min離心5 min，收集血清(溶血標本棄去)，-80 ℃冰箱低溫保存。采用ELISA法檢測血清IL-17、ET-1、ox-LDL、VCAM-1，操作步驟按照試劑操作說明書進行，在酶標儀上檢測其在450 nm波長處的OD值。每份標本做3個復孔，同時做標準曲線孔并設置空白對照孔和陰性對照孔。根據標準曲線孔的OD值與濃度得到標準曲線公式，對照標準曲線代入標本實測OD值換算出濃度值。

2 結果

2.1 各組外周血Th17比例比較 健康青年組、健康中年組、健康老年組和老年腦梗組的外周血Th17比例分別為0.96%±0.18%、1.47%±0.30%、2.38%±0.33%、4.09%±1.07%。老年腦梗組外周血Th17比例高于各組健康人群(P均<0.05)；健康老年組外周血Th17比例高于健康青年組和健康中年組(P均<0.05)。見表2。

2.2 各組血清IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL比較 老年腦梗組血清IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL水平高于各組健康人群(P均<0.05)；健康老年組血清IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL水平高于健康青年組和健康中年組(P均<0.05)。見表2。

2.3 各組Th17比例、IL-17水平與ET-1、VCAM-1、ox-LDL水平的相關性 各組外周血Th17比例與血清VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平呈正相關(r分別為0.847、0.815、0.809，P均<0.01)。血清IL-17水平與血清VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平亦呈正相關(r分別為0.770、0.715、0.744，P均<0.01)。見圖1。

表2 各組人群外周血Th17比例和血清IL-17、ET-1、VCAM-1、ox-LDL水平比較

注：與健康青年組和健康中年組比較，★P<0.05；與健康老年組比較，△P<0.05。

圖1 外周血Th17比例、血清IL-17水平與血清VCAM-1、ox-LDL、ET-1水平的相關性

3 討論

隨年齡增長，機體的結構及組織代謝率等各方面指標都有所下降。有學者把機體的細胞免疫指標改變作為衰老的特征[8]。現有研究[9，10]曾報道老年人及小鼠體內Th17比例和功能改變情況。ACI的發生主要是由向腦部供應血液的動脈發生血栓導致，其主要病理學基礎為AS及斑塊的破裂。AS是心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病的病理基礎。AS的病因學說有很多，包括內皮損傷、脂質代謝異常、炎癥學說等，但具體發生機制尚未明確，其中，炎癥學說日益受到學者的認可[11,12]。AS也被認為是一種炎癥性疾病，T細胞作為重要的免疫細胞，在動脈粥樣硬化發生發展中發揮重要作用[13]。

Th17是由初始T細胞在IL-6、轉化生長因子β(TGF-β)等的誘導下分化而成[11]。臨床研究中發現，在AS動脈斑塊中有大量T細胞浸潤，這其中就包含了Th17的存在。淋巴細胞分泌的細胞因子可促進血管內皮細胞分泌VCAM-1、ET-1等細胞因子和趨化因子[14]，這些因子又促進斑塊破裂形成血栓。Th17被認為是動脈粥樣硬化的致病因素之一，參與粥樣斑塊破裂的炎癥過程[15]。衰老與T細胞免疫有關，包括胸腺萎縮和T細胞亞群變化[16]。但Th17在衰老進程和ACI發生中的作用尚不明確。為了闡明Th17在衰老進程和ACI發生中的作用，我們檢測了健康青年人、健康中年人、健康老年人及老年ACI患者外周血中的Th17。本研究發現，與健康青年人和健康中年人相比，健康老年人外周血Th17比例及血清IL-17、VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平顯著提高。同時，老年ACI患者外周血Th17比例及血清IL-17、VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平均顯著高于健康老年人、健康中年人和健康青年人。另外本研究還發現，外周血Th17比例、IL-17水平與VCAM-1、ET-1、ox-LDL均呈正相關。

內皮細胞的衰老和損傷是血管病變的初始事件[17]。血管內皮細胞衰老過程中，VCAM-1和ET-1的過度表達使得白細胞聚集并黏附在內皮細胞上，從而加劇了血管壁的破壞和組織缺氧的炎癥反應[18]。本研究結果顯示，老年人體內Th17表達增高與內皮細胞衰老有關，作為Th17的特異性因子，IL-17有可能誘導內皮細胞衰老，進而參與動脈粥樣硬化和ACI發生。而ox-LDL為重要的致動脈粥樣硬化因子。本研究發現，隨著年齡增長，ox-LDL水平增高。健康老年人較健康青年人和健康中年人體內ox-LDL水平明顯上升，而老年ACI患者ox-LDL水平又明顯高于老年健康人群。這表明ox-LDL不僅在動脈粥樣硬化、ACI發生中發揮重要作用，還與衰老密切相關。ACI病因復雜，脂質代謝障礙為其病變基礎，但最重要的病理過程是巨噬細胞吞噬ox-LDL形成泡沫細胞并沉積在血管內膜。Th17分泌的IL-17能夠誘導炎癥因子和趨化因子分泌，加重局部組織損傷[19]。在本研究中，Th17比例、IL-17水平與ox-LDL水平呈正相關，提示在衰老或ACI過程中，Th17、IL-17與ox-LDL之間存在相互作用關系。本課題組前期研究也發現Th17參與ACI的發生[20]。

綜上所述，健康老年人外周血Th17比例及血清IL-17、VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平增高，在老年ACI患者增高更明顯；而且，Th17比例、IL-17水平與VCAM-1、ET-1、ox-LDL水平均呈正相關。上述研究結果提示，Th17/IL-17可能在衰老及ACI的發生過程中發揮重要作用。