甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織及血清中miR-1296表達變化及意義

季昳弛，喬德輝，周翔宇，何雪梅，楊輝，程煉

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

甲狀腺腫瘤是最常見的內分泌腫瘤之一。甲狀腺腫瘤分為良、惡性，其中約80%的惡性甲狀腺腫瘤為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[1～4]。大部分PTC預后較好，仍有部分患者術后復發及遠處轉移。目前術前診斷PTC的金標準是細針穿刺活檢(FNA)，然而受腫瘤大小、位置、性質和操作人員水平等影響，約有30%的樣本不能確診。因此，尋找PTC診斷、術前風險評估、監測復發的標志物有重要意義[5]。微小RNA(miRNA)是長度為18～22 bp的非編碼單鏈RNA，在轉錄后水平上調節基因表達。miRNA與PTC發生、進展密切相關。研究發現，miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p等與PTC的生長有關，可協助FNA診斷[6]。Lee等[7]發現，miR-222、miR-146b與PTC的進展及復發相關。研究表明，miR-9和miR-21在PTC術后復發患者中表達降低，二者有望作為監測腫瘤復發的標志物[8]。文獻報道，在三陰性乳腺癌中，miR-1296能抑制細胞增殖并增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[9]。miR-1296還被發現在前列腺癌組織中表達下調，導致處于細胞周期S期的細胞比例減少[10]。本研究觀察了miR-1296在PTC患者腫瘤組織及血清中的表達變化，分析miR-1296表達與PTC臨床病理參數的關系，并初步探討miR-1296對PTC發生發展的影響機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 PTC組織及血清樣本來源 選取2015年6月～2016年6月于西南醫科大學附屬醫院行手術治療的甲狀腺腫瘤患者65例，其中PTC 30例、良性腫瘤35例。PTC患者中，男11例，女19例；年齡>45歲 17例，≤45歲13例；腫瘤直徑>2 cm 15例，腫瘤直徑≤2 cm 15例；單發腫瘤17例，多發腫瘤13例；T1期12例，T2～4期18例；N0期13例，N1期17例；ASA風險分級低危組19例，中高危組11例；經典型PTC 26例，濾泡型PTC 4例；血清中甲狀腺球蛋白水平>77 ng/mL者16例，≤77 ng/mL者14例。良性腫瘤患者中，男10例，女25例；年齡>45歲15例，≤45歲20例；腫瘤直徑>2 cm 12例，腫瘤直徑≤2 cm 23例。術中取離體腫瘤組織及距腫瘤>1 cm的正常甲狀腺組織于液氮中速凍，-80 ℃保存。另選擇35例行甲狀腺手術的PTC患者，分別于術前1 d及術后1 d采集促凝外周血，離心取上清，-80 ℃保存。本研究經西南醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 PTC組織及血清miR-1296檢測 采用實時熒光定量PCR法。取100 mg組織在液氮中研磨成粉末，提取總RNA，檢測總RNA濃度及純度，瓊脂凝膠電泳成像檢測RNA完整性。取200 μL血清樣品，按照QIAGEN miRNeasy serum/plasma Kit試劑盒說明書提取血清RNA。分別取500 ng組織RNA或6 μL血清RNA，按照miScript Ⅱ RT kit試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。組織PCR反應步驟：95 ℃ 15 min;然后95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共40個循環。血清PCR反應步驟：95 ℃ 15 min；然后94 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，共5個循環；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共40個循環。組織檢測以U6作為內參，血清檢測以cel-miR-39作為內參。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。

1.3 miR-1296的生物學信息分析 通過Targetscan預測miR-1296靶基因，GEPIA分析TCGA、GTEx數據庫中甲狀腺癌基因表達變化。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。符合正態分布的計量資料采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的計量資料采用秩和檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血清miR-1296對PTC的診斷價值，用MedCalc軟件分析ROC曲線下面積(AUC)及最佳截斷值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTC組織、良性腫瘤組織及癌旁正常甲狀腺組織中miR-1296表達比較 PTC組織、良性腫瘤組織及癌旁正常甲狀腺組織中miR-1296相對表達量分別為0.61±0.12、0.62±0.11、1.59±0.38。PTC組織、良性腫瘤組織中miR-1296相對表達量低于癌旁正常甲狀腺組織(P均<0.05)。

2.2 miR-1296表達與PTC臨床病理參數的關系 腫瘤直徑>2 cm者腫瘤組織中miR-1296相對表達量低于腫瘤直徑≤2 cm者，TNM分期Ⅱ～Ⅳ期者腫瘤組織中miR-1296相對表達量低于Ⅰ期者(P均<0.05)。詳見表1。

2.3 PTC患者手術前后血清miR-1296表達比較 患者手術前后血清miR-1296表達量分別為1.12±0.98、6.02±1.92。術后血清miR-1296表達量較術前增高(P<0.05)。

2.4 血清miR-1296對PTC的診斷效能 ROC曲線分析顯示，血清miR-1296診斷良性腫瘤和PTC的AUC分別為0.780、0.790。血清miR-1296診斷良性腫瘤的敏感度為81%，特異度為71%；診斷PTC的敏感度為64%，特異度為86%。見圖1。

表1 miR-1296相對表達量與PTC臨床病理參數的關系(M)

圖1 血清miR-1296診斷PTC的ROC曲線

2.5 miR-1296對PTC發生發展的作用機制 Targetscan預測發現，MAP17可能是miR-1296的靶基因；GEPIA分析TCGA及GTEx數據庫中甲狀腺癌基因表達，發現MAP17在甲狀腺癌中的表達升高。推測miR-1296可能通過負性調控MAP17表達，參與PTC的多個生物學過程。

3 討論

PTC是起源于甲狀腺濾泡細胞的惡性腫瘤，近年來其發病率明顯升高[11]。雖然PTC的手術效果很好，但仍有少數患者出現局部復發或遠處轉移。超聲引導的FNA通常用于檢測原發性、轉移性病變及復發性病變。PTC患者術后管理的目的是早期發現腫瘤復發[12]。目前超聲、CT、FDG-PET/CT檢查可用于檢測轉移性病變或復發，但這些檢查手段費用較高且耗時。尋找PTC的血清學標志物有助于解決這一問題[13]。

miRNA在人腫瘤形成和進展中具有重要作用。多種miRNA在惡性腫瘤組織中異常表達或缺失[14]。某些特定miRNA可預測人類惡性腫瘤的惡性程度和臨床結局。許多癌基因或抑癌基因受miRNA調節網絡的靶向調節[15]。miRNA具有腫瘤促進和腫瘤抑制活性，miRNA靶向治療有望成為惡性腫瘤治療的新方案。此外，miRNA編碼基因常受到遺傳改變(包括染色體重排和點突變)的影響，這種miRNA靶向遺傳改變已經被認為是惡性腫瘤的特異性標簽[15]。因此，miRNA表達譜有望用于腫瘤診斷和預后評價。

已有文獻報道，miR-1296參與了多種腫瘤的發生發展。Tao等[16]認為miR-1296可能參與了結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Xu等[17]研究發現，miR-1296通過靶向作用于SRPK1介導的PI3K/AKT途徑抑制肝細胞癌的轉移和上皮-間質轉化。Phan等[18]發現miR-1296在三陰性乳腺癌中發揮著腫瘤抑制因子的作用。而關于miR-1296在PTC中的表達報道較少。本研究結果顯示，PTC組織、良性腫瘤組織中miR-1296相對表達量低于癌旁正常甲狀腺組織；腫瘤直徑>2 cm者腫瘤組織中miR-1296相對表達量低于腫瘤直徑≤2 cm者，TNM分期Ⅱ～Ⅳ期者腫瘤組織中miR-1296相對表達量低于Ⅰ期者。這提示miR-1296低表達可能參與了PTC的發病，并與PTC的進展有關。對PTC患者血清miR-1296進行檢測發現，術后血清miR-1296表達較術前增高，血清miR-1296對PTC的診斷敏感度為64%、特異度為86%，提示血清miR-1296檢測對PTC有一定的診斷效能。此外，我們還分析了miR-1296與腫瘤亞型、ASA分級、性別、甲狀腺球蛋白、病灶數目的關系，但未得出有統計學意義的結果，可能與樣本量較少有關。

現已報道的miR-1296靶基因有SRPK1、KEGG等[16，17]。miRNA調節網絡非常復雜，一個miRNA可結合多個靶基因，且在不同條件下可結合不同的靶基因[18]。我們通過生物信息學分析發現MAP17的3′ UTR區與miR-1296存在15個結合位點。MAP17(DD96，PDZKIP1)是一種相對分子質量17 kD的非糖基化的膜相關蛋白，其過表達于結腸癌、乳腺癌、肺癌等多種人類腫瘤中。MAP17與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、遠處轉移、耐藥等密切相關[19]。我們通過分析發現miR-1296與MAP17存在結合位點，二者表達呈負相關，提示在PTC中miR-1296可能通過靶向作用于MAP17發揮生物學功能。

結合上述研究結果，我們認為，miR-1296在PTC患者腫瘤組織及血清中表達降低，與PTC的發病和進展有關；miR-1296可能通過對其靶基因MAP17的負性調控抑制PTC的發生與進展。但本研究樣本量較少，后期我們還需進一步加大樣本量、深入分析以驗證上述結論。