大黃素對刀豆蛋白誘導小鼠急性肝損傷的干預作用及其機制

薛繼華，謝琴秀，程君，尹華發，葉英，李家斌

(安徽醫科大學第一附屬醫院，合肥230022)

急性重型肝炎以肝功能的嚴重惡化為特征，起病急，進展迅速，病死率高。急性重型肝炎可由病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、乙醇及毒物等因素導致，在中國最常見的原因是病毒性肝炎。除了病情發展迅猛外，急性重型肝炎難防難治的另一原因是主導肝炎早期發展的關鍵分子不明確，缺乏特異、有效的治療靶點和干預手段。刀豆蛋白(Con A)誘導的小鼠肝炎在很多方面較好地模擬了人類急性重型肝炎過程，如肝細胞大面積變性壞死、肝組織內淋巴細胞浸潤、T細胞與NK細胞的激活及多種細胞因子水平升高等。前期研究中我們采用此法構建急性重型肝炎模型，利用芯片技術篩選表達受Con A影響的基因，結果發現1 473個基因表達差異明顯[1,2]，糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)是其中之一，其配體為GITRL[3]。GITR高表達于調節性T細胞(Treg)表面，與GITRL相互作用能消除Treg的免疫抑制作用。有研究證實大黃素可抑制乙型肝炎病毒(HBV)復制[4,5]。我們既往研究證實大黃素可對抗Con A誘導的急性重型肝炎[6]。2016年7月～2018年6月，本研究觀察了大黃素對Con A誘導小鼠急性肝損傷的干預作用，并借GITR/GITRL信號通路探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 健康清潔級雄性6～8周齡Balb/C小鼠24只，體質量18～22 g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。Con A購自Sigma公司；TRIzol購自Invitrogen公司；定量PCR試劑SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)及反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)均購自TaKaRa公司；anti-GITR及anti-GITRL購自Abcam公司；勻漿機購自Bertin Technologies公司；電泳儀購自Bio-Rad公司；普通PCR儀2720及7900HT型熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.2 急性肝損傷模型制作及大黃素用法 24只小鼠隨機分為對照組、模型組、大黃素組，每組8只。大黃素組給予大黃素25 mg/kg灌胃，2 h后經尾靜脈注射20 mg/kg的Con A誘導急性肝損傷模型。模型組以CMC-Na(大黃素溶劑)代替大黃素預處理，2 h后以同法制作急性肝損傷模型。對照組不做特殊處理。于Con A注射10 h后以摘眼球法取血。處死小鼠，取肝組織，取一小部分以4%甲醛固定后做病理檢查，余肝組織以液氮凍存備用。

1.3 血清ALT、AST檢測 各組小鼠血液室溫自然凝固20 min后，2 000～3 000 r/min離心20 min收集上清。血清稀釋10倍后用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST。

1.4 肝組織病理觀察 各組小鼠肝組織標本常規固定、石蠟包埋、染色，光鏡下觀察肝組織學改變，評估各組小鼠肝組織損傷程度。

1.5 肝組織中GITR、GITRL mRNA及蛋白檢測

1.5.1 肝組織中GITR、GITRL mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測肝組織中的GITR、GITRL mRNA。PCR反應體系20 μL，反應條件為94 ℃預變性30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。以β-actin為內參基因。GITR基因上游引物序列為5′-CCTAGGTCAGCCGAGTGTAGTTGAG-3′，下游引物序列為5′-GTGCTTGCAGATCTTGCACTGAG-3′。GITRL基因上游引物序列為5′-CGAGTCCTGCATGGTTAA-3′，下游引物序列為5′-TCAGCTTCCCATCAGATGTC-3′。β-actin上游引物序列為5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游引物序列為5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.5.2 肝組織中GITR、GITRL蛋白檢測 采用Western blotting法。將小鼠肝組織研磨裂解后取總蛋白量相同的細胞裂解物，經10% SDS-PAGE電泳，電轉移至PVDF膜上。PVDF膜用含0.05% Tween-20溶液溶解的5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，后分別加入GITR抗體、GITRL抗體及GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜。TBST溶液洗膜10 min×4次，加入相應二抗，室溫孵育1 h后，再用TBST液洗膜10 min×4次。采用ECL顯色，膠片曝光。采用Image J圖像分析軟件對膠片條帶OD值進行量化，以目的蛋白OD值與內參蛋白OD值的比值為目的蛋白的相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行統計分析。計量數據服從正態分布且方差齊時，多組間兩兩比較采用單因素方差分析(ANOVA)；數據不服從正態分布或方差不齊時，多組間比較采用Kruskal Wallis檢驗，兩組間比較用Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較 對照組、模型組、大黃素組血清ALT水平分別為(45.2±5.7)、(6 484.0±618.6)、(110.0±12.3)U/L，AST水平分別為(57.0±6.9)、(5 321.0±784.0)、(83.2±12.0)U/L。模型組血清ALT、AST水平顯著高于對照組，大黃素組血清ALT、AST水平低于模型組(P均<0.01)。

2.2 各組小鼠肝組織病理變化 相較于對照組，模型組小鼠肝組織出現明顯壞死灶，而大黃素組小鼠肝組織壞死明顯減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織病理變化(HE染色)

2.3 各組小鼠肝組織中GITR、GITRL mRNA及蛋白表達比較 模型組GITR、GITRL mRNA相對表達量高于對照組，大黃素組GITR、GITRL mRNA相對表達量低于模型組(P均<0.05)。模型組GITR、GITRL蛋白相對表達量高于對照組，大黃素組GITR、GITRL蛋白相對表達量低于模型組(P均<0.05)。詳見表1、圖2。

表1 各組小鼠肝組織中GITR、GITRL mRNA及蛋白表達比較

注：與對照組相比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.05。

圖2 各組小鼠肝組織中GITR、GITRL蛋白表達情況(Western blotting法)

3 討論

本研究團隊既往研究發現，大黃素可對抗Con A誘導的急性重型肝炎，且Con A誘導的小鼠肝損傷組織中GITR表達升高，因此推測GITR在Con A誘導的小鼠肝損傷中可能發揮重要作用。本研究以大黃素預處理，觀察大黃素對Con A誘導小鼠急性肝損傷的干預作用，并借GITR/GITRL信號通路探討其相關機制。本研究發現，模型組血清ALT、AST水平顯著高于對照組，大黃素組血清ALT、AST水平低于模型組；相較于對照組，模型組小鼠肝組織出現明顯壞死灶，而大黃素組小鼠肝組織壞死明顯減輕。這表明大黃素可減輕Con A誘導的小鼠肝損害。進一步實驗結果顯示，模型組GITR、GITRL mRNA及蛋白相對表達量高于對照組，大黃素組GITR、GITRL mRNA及蛋白相對表達量低于模型組，提示Con A可誘導小鼠肝組織中GITR及GITRL的表達，而大黃素預處理后可顯著降低GITR及GITRL的表達水平。

GITR為70 kD的同源二聚體跨膜糖蛋白，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要表達于胸腺和外周淋巴器官的靜息性Treg中，在CD4+CD25-T細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞上也有少量表達，但這些細胞活化后GITR表達增加[7,8]。Shimizu等[9]用流式細胞儀檢測GITR在Balb/C小鼠體內的分布，發現其在脾和淋巴結的Treg及胸腺中的CD4+CD25+T細胞上均呈高表達。1999年和2003年，人類和鼠的GITRL也分別被克隆出來[9～11]，為Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表達在樹突狀細胞、B細胞、巨噬細胞和內皮細胞上，在靜息性和活化的T細胞上不表達[12,13]。目前普遍認為GITR/GITRL是T細胞的共刺激分子，增強GITR/GITRL共刺激信號的作用有助于機體清除感染、發揮抗腫瘤免疫的作用[14,15]。另一方面，GITR/GITRL的相互作用可打破Treg介導的免疫耐受，從而誘發或加重自身免疫性疾病。因此，GITR/GITRL調節了Treg和效應性T細胞之間的功能平衡。

Treg在維持機體免疫耐受狀態、防止自身免疫疾病發生、抗移植物排斥及腫瘤免疫中發揮重要作用[16]。Treg上有許多重要的表面分子，其中GITR的表達引起了人們的關注，因為用GITR抗體(DTA-1)可消除Treg的抑制活性[17]。DTA-1在此不是起封閉作用，而是激發GITR，即起到生理性GITRL的作用。Patel等[18]以抗GITR單抗注入關節炎鼠模型后，炎癥惡化，同時伴有TNF、干擾素、膠原特異性IgG1的升高；GITR單抗刺激同樣可以加劇卵清蛋白(OVA)誘導的鼠哮喘模型的氣道炎癥。研究[19]指出，GITR/GITRL相互作用增強了ILC2s的活性，促進了哮喘的發病。 Shimizu等[17]報道小鼠接受抗GITR抗體刺激后3個月即被誘發自身免疫性胃炎。近年研究認為，GITR/GITRL系統可作為T細胞活化的共刺激分子，與CD28一樣起輔助刺激作用[20]。許多動物模型也驗證了GITR信號對T細胞具有共刺激活化作用并抑制Treg活性，促進免疫系統的過度活化，從而誘發或加劇自身免疫性疾病[18,21]。GITR/GITRL的相互作用不僅可刺激效應性T細胞的增殖，還可打破Treg介導的免疫耐受，因此，GITR/GITRL系統的紊亂必將導致免疫平衡失調。

本研究結果提示，大黃素可能通過抑制GITR/GITRL通路發揮對Con A誘導小鼠肝損傷的干預作用。我們推測，在Con A誘導的急性重型肝炎中，GITRL與GITR相互作用，刺激效應性T細胞的增殖，打破Treg介導的免疫耐受增強，促進免疫系統的過度活化；而大黃素可通過抑制GITRL與GITR的表達從而抑制其功能，最終發揮抗肝損傷的作用。