人肝癌細胞株中PTPRD表達變化及其對HuH-7細胞增殖、遷移的影響和機制

田婧，蒙秋華，董敏

(廣西醫科大學藥學院，南寧530021)

肝癌(HCC)是常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率逐年升高[1]。雖然HCC的早期診斷和治療取得了重大進展，但總體治療效果仍不理想[1，2]。蛋白酪氨酸磷酸酶D(PTPRD)基因是蛋白酪氨酸家族(PTPs)的重要成員[3，4]。PTPs可調節細胞的生長、代謝、免疫應答和重要的細胞信號通路轉導[4]。越來越多的研究表明，PTPRD基因可作為一種抑癌基因，與多種惡性腫瘤的發生發展有關[5～7]。有文獻報道[8]，PTPRD基因在肝癌細胞中表達缺失或失活，PTPRD基因高表達可明顯抑制肝癌細胞的生長，但具體機制尚不明確。近年來有研究表明，肝癌的發生發展涉及多種信號通路轉導異常[9，10]，如磷脂酰肌醇3(PI3K)-蛋白激酶B(PKB/Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路。但關于PTPRD基因是否可以調控PI3K-Akt-mTOR信號通路對肝癌發生發展產生影響，目前尚未見文獻報道。2017年12月～2018年8月，本研究觀察了上調PTPRD基因表達對肝癌細胞增殖、遷移的影響，并基于PI3K-Akt-mTOR信號通路蛋白表達變化探索相關機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 正常肝細胞LO2購于武漢普諾賽生命科技有限公司，肝癌細胞株HepG2購于上海美軒公司，肝癌細胞株HuH-7購于中科院上海細胞庫。DMEM高糖培養基購于美國Gibco公司。胎牛血清購于以色列BI公司。四甲基偶氮唑鹽試劑購北京索萊寶公司。PTPRD過表達和陰性對照腺病毒購于上海吉凱基因化學技術有限公司。PTPRD和GAPDH引物序列購于上海英濰捷基公司。RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR擴增試劑盒均購于日本TaKaRa公司。PTPRD、mTOR、p-mTOR、GAPDH抗體均購于美國Abcam公司。Akt和p-Akt抗體購于美國Cell Signaling Technology試劑公司。BSA粉末購于上海碧云天公司。ECL顯影液購于美國Millipore公司。

1.2 LO2、HepG2、HuH-7細胞中PTPRD mRNA及蛋白表達觀察

1.2.1 PTPRD mRNA檢測 采用過柱法提取各組細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，并進行PCR反應。PTPRD上游引物序列為5′-TTTACACGAACACCCGTTGA-3′，下游引物序列為5′-CGGAGTCCGTAAGGGTTGTA-3′。內參GAPDH上游引物序列為5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′，下游引物序列為5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。PCR反應體系為20 μL。以2-ΔΔCt表示PTPRD mRNA相對表達量。

1.2.2 PTPRD蛋白檢測 RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。分別取各組適量總蛋白加入4×上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱8 min；配置8%分離膠+5%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，電泳后轉印至PVDF膜；用含5% BSA的TBST溶液室溫搖床封閉PVDF膜1 h，TBST洗滌3次，每次5 min；將PVDF膜分別放入一抗稀釋液中，4 ℃冰箱孵育過夜；從孵育盒中取出PVDF膜，TBST洗滌3次，每次5 min;放入二抗中室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min；ECL顯影，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 上調PTPRD基因表達對HuH-7細胞增殖、遷移的影響觀察

1.3.1 PTPRD基因表達上調的HuH-7細胞構建 將處于對數生長期的HuH-7細胞消化，以3×105/孔接種于6孔板中，將細胞分為PTPRD上調組和陰性對照組，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中培育24 h。根據腺病毒轉染說明書分別轉染PTPRD過表達腺病毒和陰性對照腺病毒，轉染10 h后更換新的培養基繼續培養。轉染48 h后，使用熒光顯微鏡觀察各組熒光表達情況并拍照，各組轉染效率>95%。采用實時熒光定量PCR法檢測兩組細胞中的PTPRD mRNA，采用Western blotting法檢測PTPRD蛋白。PTPRD上調組和陰性對照組PTPRD mRNA相對表達量分別為 8.94±0.13和1，PTPRD蛋白相對表達量分別為1.48±0.02、1.30±0.03，PTPRD上調組PTPRD mRNA及蛋白相對表達量均高于陰性對照組(P均<0.01)。PTPRD過表達細胞模型構建成功。

1.3.2 HuH-7細胞增殖能力檢測 兩組細胞消化后分別以5×103/孔接種于96孔板中，24 h后更換無血清培養基繼續培養實現同步生長，分別于0、24、48、72 h后避光，在每孔中加入20 μL的MTT試劑，繼續放置于培養箱中培養，4 h后去培養基，每孔加入150 μL的DMSO溶液，在37 ℃搖床上混勻15 min，檢測490 nm波長處的光密度(OD)值，以PTPRD上調組與陰性對照組OD值的比值表示細胞增殖能力。

1.3.3 HuH-7細胞遷移能力檢測 轉染48 h后，將PTPRD過表達組和陰性對照組的細胞分別消化，以1×105/孔接種于48孔板中，24 h后細胞貼壁，吸出原有培養基，用200 μL的槍頭垂直于孔板底部劃“1”，用PBS沖洗細胞碎片2次后加入無血清培養基繼續培養，并分別于劃痕0、48 h后用顯微鏡觀察、拍照記錄各組轉染細胞的遷移情況。細胞遷移率=(劃痕后0 h的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后0 h的劃痕面積。

1.4 HuH-7細胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白檢測 采用Western blotting法檢測兩組細胞中的Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白，方法參照“1.2.2”。

2 結果

2.1 LO2、HepG2、HuH-7細胞中PTPRD mRNA及蛋白表達比較 LO2、HepG2、HuH-7細胞中PTPRD mRNA相對表達量分別為1、0.002±0.001、0.000 069 4±0.000 012 3，PTPRD蛋白相對表達量分別為1.73±0.15、0.80±0.12、0.70±0.06，HepG2細胞、HuH-7細胞中PTPRD mRNA及蛋白相對表達量均低于LO2細胞(P均<0.05)。選取PTPRD mRNA和蛋白相對表達量最低的HuH-7細胞進行后續實驗。

2.2 兩組HuH-7細胞增殖能力比較 PTPRD上調組細胞貼壁0、24、48、72 h時細胞增殖能力分別為0.17 ±0.01、0.28±0.01、0.58±0.02、0.86±0.02，陰性對照組分別為0.19±0.01、0.38±0.03、0.82±0.01、1.30±0.04，PTPRD上調組細胞貼壁24、48、72 h時細胞增殖能力低于陰性對照組(P均<0.05)。見圖1。

注：與PTPRD上調組相比，*P<0.05。

2.3 兩組HuH-7細胞遷移率比較 劃痕48 h后， PTPRD上調組和陰性對照組細胞遷移率分別為0.09±0.01、0.23±0.01，PTPRD上調組細胞遷移率低于陰性對照組(P<0.01)。見圖2。

圖2 兩組HuH-7細胞劃痕后0、48 h細胞遷移情況

2.4 兩組HuH-7細胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達比較 PTPRD組上調組細胞中Akt、mTOR蛋白相對表達量分別為1.01±0.04、0.96±0.02，p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR分別為0.65±0.02、0.72± 0.03；陰性對照組分別為1.22±0.12、1.11±0.08、1.02±0.01、1.32±0.09。PTPRD上調組細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR均低于陰性對照組(P均<0.01)。

3 討論

肝癌惡性程度高、預后極差。雖然近年來肝癌的相關基礎研究和臨床研究取得了巨大進展，但由于肝癌的發生發展機制尚不明確，肝癌的預防、診斷和治療仍面臨重重阻礙。此外，由于肝癌的惡性程度高、侵襲性極強及治療后復發率、轉移率高，導致患者的總體預后普遍較差，5年生存率不足10%[11，12]。因此，進一步闡明肝癌的發病機制，尋找新的基因治療靶點，對肝癌的預防、早期診斷、治療水平的提高、改善患者生存質量等方面具有重要意義。

PTPRD基因位于9p23-p24.3，其基因編碼的蛋白包含1 912個氨基酸，在正常腦、肝臟、胰臟、脂肪組織等組織中高表達[3，4]。隨著對PTPRD基因的研究不斷深入，越來越多的研究顯示，PTPRD基因在肝癌、神經母細胞瘤、肺癌和黑色素瘤等多種惡性腫瘤中均存在表達缺失或表觀遺傳學變化，并且誘導PTPRD基因過表達后可明顯抑制腫瘤細胞的生長[5～8]。以上研究結果提示，PTPRD基因與肝癌細胞的生長有關，但其機制尚不清楚。我們通過初步實驗發現，PTPRD mRNA及蛋白在人正常肝細胞株LO2和肝癌細胞株HepG2、HuH-7中的表達水平有顯著性差異，且HuH-7細胞中PTPRD表達低于HepG2細胞，提示PTPRD表達缺失可能與肝癌的發病有關。對不同肝癌細胞系同一基因表達的差異進行深入研究，可能會對不同病因所引起的肝癌的治療和預后評估有重要指導意義。我們成功構建了PTPRD基因過表達的HuH-7細胞，發現PTPRD基因過表達后可明顯抑制肝癌細胞的增殖和遷移。以上研究結果均表明，PTPRD基因在人肝癌細胞中低表達，可作為一種抑癌基因參與肝癌的發生發展過程。

研究表明PTPs家族成員在細胞內均具有兩個磷酸酶活性的結構域D1和D2，可以與酪氨酸激酶共同調節細胞內的酪氨酸磷酸化和去磷酸化過程，參與調節細胞信號轉導通路[4]。此外，有文獻報道，一些PTPs家族成員可負性調控PI3K-Akt-mTOR信號通路，抑制腫瘤細胞的生長，如蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-1)[13]、磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)等[14]。PI3k-Akt-mTOR信號通路是體內一條重要的信號轉導通路，能夠調控細胞的增殖、遷移和侵襲[15，16]。研究[16～19]發現，該信號通路在肝癌、胃癌、乳腺癌、神經母細胞瘤等多種惡性腫瘤細胞中均存在功能異常，與腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡有關。PTPRD基因作為PTPs家族的重要成員之一，其能否調控PI3k-Akt-mTOR信號通路，影響肝癌細胞的增殖與遷移尚無相關文獻報道。本研究檢測了兩組HuH-7細胞中PI3k-Akt-mTOR信號通路的關鍵蛋白Akt、p-Akt、TOR、p-mTOR，結果發現，PTPRD基因過表達可降低肝癌細胞中p-Akt、p-mTOR蛋白的表達水平，抑制PI3k-Akt-mTOR信號通路激活，提示PTPRD基因可能參與負性調控PI3k-Akt-mTOR信號通路，抑制肝癌細胞的增殖與遷移。

綜上所述，PTPRD可能通過調控PI3K-Akt-mTOR信號通路，抑制肝癌細胞的增殖和遷移，其有望作為潛在的肝癌治療靶點。但由于現階段相關研究較少，且體內的信號通路轉導錯綜復雜，僅憑細胞水平實驗研究無法全面闡述PTPRD表達上調后對肝癌細胞的作用效應。因此，今后可以從表觀遺傳學、動物實驗及臨床試驗等方面展開更深入的研究和探討，為肝癌的治療提供新思路。