圍產期奶牛高酮血癥血液生化指標的監測

張廣和,李國鵬,韓天龍,3,劉國文

(1.吉林大學動物醫學學院,吉林 長春 130062；2.內蒙古赤峰市國營農牧場綜合服務站,內蒙古 赤峰 024000；3.內蒙古赤峰市農牧科學研究院,內蒙古 赤峰 024031)

奶牛圍產期是指妊娠奶牛分娩前Antepartum(A.P.)和分娩后Postpartum(P.P)的一段時期,一般指產前3周和產后3周,國外多稱之為過渡期。奶牛高酮血癥(酮病)是高產奶牛產后因碳水化合物和脂肪酸代謝紊亂而引起的一種群發、高發性能量代謝紊亂性疾病[1]。其發病率高,在我國奶牛酮病發病率約為15% ～30%,常發生在3胎～5胎的高產奶牛。該病主要是由于圍產期能量攝入不能滿足機體需要,而發生能量負平衡,為了應對這種負平衡,體脂和體蛋白被動員,長期便會引發機體的代謝紊亂。圍產期能量負平衡引起圍產期和泌乳期奶牛各種生產性疾病,如酮病、真胃變位、脂肪肝、胎衣不下等。血糖及血酮的測定仍然是診斷奶牛酮病的主要指標,血糖降低、酮體增加是酮病的臨床病理學變化,但高血糖、高酮血的Ⅱ型酮病發生可能與胰島素抵抗有關[2]。通過圍產期奶牛酮病的發病率調查可以了解奶牛能量負平衡的嚴重程度,也為飼養管理提供了一些參考數據,此外對于血液肝功能、礦物質等其他生化指標的監測可從多方面了解酮病發生的規律及群體疾病預警,為疾病早期干預帶來了幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 本試驗選取吉林省長春市某奶牛場圍產期荷斯坦奶牛171頭,通過臨床酮病初篩結合血液相關指標和臨床癥狀、胎次、產奶量、體況評分、干物質攝入量最終確定10頭奶牛為本實驗高酮血癥奶牛。高酮血癥奶牛的判定標準是血清BHBA＞1.2 mmol/L、GLU ＜2.5 mmol/L、NEFA ＞0.5 mmol/L。 另外選取10頭健康奶牛作為對照組。兩組奶牛日糧均按NRC標準配制。在發病率調查中,以周為時間單位,選取7個時間點,每個時間點不少于17頭奶牛。試驗組和對照組所有奶牛均采用舍飼,自由采食。

1.2 循環血液樣本的采集 根據場內管理系統記錄,計算奶牛預產期,選擇產前3周(21 d)、2周(14 d)、1周(7 d)、分娩當天(0)和產后1 周(7 d)、2 周(14 d)、3周(21 d)7個時間點的圍產期奶牛和健康奶牛,每頭奶牛血液樣品的采集均于清晨投飼前頸靜脈(或尾部靜脈)無菌采集20 mL,10 mL肝素鈉抗凝處理用做分離血漿,另10 mL血液不添加抗凝劑用做分離血清。3 800 r/min離心10 min,收集血漿(或血清)于事先準備好的無菌凍存管中,準確標記后,-80℃保存待測。

1.3 測定項目和方法 測定指標有葡萄糖(GLU)、β-羥丁酸(BHBA)、非酯化脂肪酸(NEFA)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)、鈣(Ca)、鎂(Mg)和磷(P)。以上指標于吉林大學第四醫院醫學檢驗科測定,具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 數據統計與分析 數據采用SPSS 19.0軟件進行分析,組間差異顯著性采用ONE-WAY ANOVA進行分析,測定指標與NEFA、BHBA的相關性采用Bivariate Correlations皮爾遜檢驗分析,結果用平均值±標準差(Mean±SD)表示。利用 SPSS 19.0-ROC-Curve程序建立ROC曲線,比較各指標曲線下面積(Auc),利用公式：Younde指數 =敏感度 -(1-特異度),計算YI最大值,其對應的檢測值即為cut-point,其中Se表示正確判斷病牛的比率,Sp表示正確判定非病牛的比率,Se越高表明漏診幾率越小,Sp越高表明誤診概率越小。本試驗以Se大于等于0.70作為具有診斷意義的可能下限。Auc＞0.5時,其值越大表明該指標的診斷準確性越高,如果Auc＜0.5則表明該指標無診斷價值。

2 結果

2.1 圍產期奶牛高酮血癥發病率調查 如圖1所示,產前無高酮血癥發生,至分娩后發生率逐漸增加,呈上升趨勢,在產后14 d達到最高發生率(10%),隨后下降至4.8%,從時間來看,高酮血癥的發生在分娩后1-3周,產后14 d最高。

圖1 圍產期奶牛高酮血癥發病率/%

2.2 高酮血癥奶牛血液生化指標改變及其與NEFA、BHBA的相關性分析如表1所示,高酮血癥奶牛血液GLU、Ca濃度顯著低于健康奶牛,P顯著高于健康奶牛。血液TBIL(R=0.729,P=0.000)、DBIL(R=0.697,P=0.001)、IBIL(R=0.708,P=0.000)、AST(R=0.720,P=0.000)濃度與 NEFA在P＜0.01水平上呈顯著正相關；血液濃度NEFA(R=0.618,P=0.004)與BHBA在P＜0.01水平上呈顯著正相關,血液 P(R=0.504,P=0.024)在BHBA在P＜0.05水平上也呈顯著正相關,但GLU(R=-0.881,P=0.000)、Ca(R=-0.738,P=0.000)在P＜0.01水平上與BHBA呈顯著負相關,在P＜0.05水平上TG(R=-0.543,P=0.013)、GGT(R=-0.525,P=0.017)濃度與BHBA呈顯著負相關。

表1 高酮血癥奶牛血液生化指標與NEFA、BHBA的相關性分析結果

2.3 圍產期高酮血癥奶牛危險因素分析與評價 運用Logistic回歸法,以是否發生低血糖為因變量,自變量包括NEFA、BHBA等幾個血液指標因素,篩選出獨立危險因素,納入標準為 α=0.05,NEFA(OR=7.72)強聯系,TG(OR=7.03)強聯系,GGT(OR=6.708)強聯系,LDH(OR=4.45)強聯系,P(OR=6.23)強聯系。見表2。

表2 圍產期高酮血癥奶牛危險因素評價

在高血酮危險因素評價中應用Logistic回歸分析造模模擬各生化指標與高酮的危險性,分為3個模型,一是與能量相關指標；二是肝功能指標；三是礦物質指標。由于能量相關指標無離群值無法分析。肝功能造模后由表3可知,各肝功能指標無顯著性差異；而從表4看出,GGT(P=0.01),LDH(P=0.035)差異顯著故不應舍去,可作為參考。表5看出,肝功能指標對高酮血陰性預測達90%,對陽性預測為80%。最終造模表達式為：

Y=0.283TBIL-4.350DBIL+0.142AST-0.513GGT+0.006LDH-2.561

表3 方程中的變量

表4 不在方程中的變量

表5 預測指標分類

礦物質指標造模后,由表6可知,礦物質指標對高酮血癥預測不顯著,但表7顯示Ca(P=0.001),P(0.013)對高酮血癥顯著,故應保留。表8可知,礦物質指標對高酮血癥陰性預測達100%,陽性預測90%。最終造模表達式為：

Y=-87.657 Ca+64.935Mg-11.594P+152.989。

表6 方程中的變量

表7 不在方程中的變量

表8 預測指標分類

2.4 高相關性血液生化指標在奶牛高酮血癥診斷中的效用評價及參數確定 如中插彩版圖2和表9所示,利用 ROC曲線分析,血液中高相關性指標Auc分別為 TG(0.15)、TBIL(0.395)、DBIL(0.535)、IBIL(0.385)、AST(0.690),其中只有DBIL和AST的Auc面積大于0.5,利用Youden指數計算Cut-point值分別DBIL(1.15)、AST(73.5)。

圖2 部分血液指標對奶牛高酮血癥診斷的ROC曲線比較

表9 血液指標在奶牛高酮血癥診斷中的靈敏度、1-特異度和臨界點

3 討論

酮病可以分為原發性酮病和繼發性酮病,原發性酮病是以能量負平衡為病理學基礎,繼發性酮病是以任何能引起奶牛食欲減退或消化吸收障礙的疾病為病因,此外礦物質缺乏、內分泌紊亂、應激也是引起酮病的誘因。發病率調查結果顯示,產前無高酮血癥發生,至分娩后發生率逐漸增加,呈上升趨勢,在產后14 d達到最高發生率(10%),隨后下降至4.8%。有統計數據表明,在我國臨床酮病發病率達2% ～20%,亞臨床酮病發生率達10%-30%[3]。在對高酮血癥獨立危險因素分析后發現NEFA(OR=7.72)強聯系,TG(OR=7.03)強聯系,GGT(OR=6.708)強聯系,LDH(OR=4.45)強聯系,P(OR=6.23)強聯系。

危險因素評價中,應用Logistic回歸分析造模模擬各生化指標與高血酮的危險性,3個模型中能量相關指標無離群值,肝功能指標GGT(P=0.01),LDH(P=0.035)差異顯著可作為參考,肝功能指標對高酮血癥陰性預測達90%,對陽性預測為80%。Ghanem[4]等人對產前4周內37頭水牛血漿中卵磷脂膽固醇脂酰轉移酶(LCAT)檢測發現濃度顯著性降低,在對37頭產后水牛進行臨床檢查發現有23頭水牛有臨床酮病,14頭奶牛有血紅蛋白尿癥狀,表明LCAT作為一種肝合成的酶,其降低可以作為酮病發生的一個預測指標。有報道,機體內超氧化物歧化酶(SOD)可以清除體內代謝產生的自由基,酮病、脂肪肝等代謝疾病與健康奶牛相比SOD含量顯著下降,但圍產期總體都下降,說明SOD減少可能是誘發此類疾病的一個危險因素,機體SOD的減少使代謝自由基破壞細胞,使細胞膜脂質過氧化能力加而發生代謝疾病[5]。礦物質元素 Ca(P=0.001),P(0.013)對高酮血癥差異顯著,應作為參考指標,對高酮血癥陰性預測達100%,陽性預測90%。ROC分析計算出高相關性因素的Cut-point值分別 DBIL(1.15)、AST(73.5)。

4 結論

圍產期奶牛高酮血癥多發于產后1～3周內,以產后第2周發病最高,產后是監測的重點。血液NEFA、BHBA、GLU是高酮血癥監測的首選指標,DBIL、AST為高酮血癥監測的參考指標,存在一定程度的肝功能異常。