實驗室檢測在羊病防控中的應用

郭 銳,田永祥,周丹娜,劉 威,段正贏,楊克禮,劉澤文,袁芳艷,高 婷

(1.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所,湖北 武漢 430064；2.農業部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室,湖北 武漢 430064；3.動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430064)

近年來,隨著我國養羊業的快速發展,養殖規模不斷擴大。但筆者發現養羊業的集約化養殖管理水平和疫病防控技術,與養豬業相比差距較大,呈現規模化粗放式管理現象,導致羊病的種類越來越多,老病新發或新的疾病不斷暴發流行,隱性感染、非典型癥狀和混合感染無處不在,僅靠流行病學、臨床癥狀和病理變化難以確診,不能及時準確制定防控措施,往往貽誤疾病治療的最佳時機,導致羊群大量死亡。因此,我國養羊業在提高飼養管理水平的同時,一定要重視實驗室檢測在羊病防控中的應用,筆者結合自身多年在家畜傳染病實驗室檢測和臨床技術服務積累的經驗,總結了以下幾點內容供廣大獸醫工作者參考。

1 實驗室主要開展的工作

實驗室檢測內容主要包括：抗體檢測、病原檢測、藥敏實驗。養殖戶可根據不同的檢測目的,選擇不同的檢測項目。

1.1 抗體檢測 抗體檢測方法一般用于羊群免疫疫苗后進行保護效果評價,常用酶鏈免疫吸附試驗(ELISA)檢測羊群的血清,該法的優點是操作簡單、時間短、可同時檢測大量樣本,對人員要求不高。但目前抗體檢測試劑盒還不能區分抗體是由疫苗株還是野毒株產生的,只有通過有沒有免疫過疫苗進行區分。實驗室目前主要使用的是已經商品化的試劑盒。

1.2 病原檢測 病原檢測主要有兩種方法：一種是病原分離鑒定,如細菌培養、動物接種等直接檢測某種病原微生物是否存在,通過微生物的形態、生化特性來進行定型；另一種是采用熒光定量PCR、膠體金等方法,檢測樣品中某種病原微生物的核酸是否存在。第一種方法做起來費時費力,第二種方法便利快捷,在較短時間就能得到結果,所以目前病原檢測主要采用的是第二種方法。熒光定量PCR檢測針對的是病原,針對性強、可確診,可確定病毒載量,確定發病的主要原因,但該方法對人員和儀器有一定的要求,需專業人員操作,專業人員需要有一定的分子生物學基礎。目前很多科研院所正在研發一種膠體金免疫層析定量分析儀,體積小可隨身攜帶,可以插入不同的抗原抗體膠體金試紙條,進行定性和定量檢測,未來幾年必將大量運作到在羊病現在的檢測中[1]。

1.3 藥敏試驗 通過病原檢測確定致病的主要致病細菌,對其進行藥敏試驗篩選敏感抗生素,一旦發生疫情就能及時使用敏感藥物進行治療。如羊鏈球菌、羊大腸桿菌、羊巴氏桿菌、羊表皮膿包(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌)等病,通過藥敏試驗治療效果很好。

2 實驗室檢測對羊病防控的意義

2.1 掌握羊群的健康狀況,找到早發現、早預防、早診斷、早治療。隨著高科技手段在獸醫領域的廣泛應用,動物疫病檢測技術也得到了普及推廣和提升,實驗室檢測、診斷水平的提高,為防控動物疫病提供了重要依據。通過病原學檢測,可以了解羊群是否攜帶或感染某種病原,定期檢測血清學的變化就可以做到防患于未然,及早發現問題,及早采取措施,起到一種預警的作用；通過抗體檢測可以了解羊群的整體免疫狀況,從而為相應措施的采取提供依據。

2.2 免疫程序制定和評估疫苗效果 在動物免疫中,通過實驗室檢測分析各地區流行病原種類、飼養模式、營養水平、品種等差異導致疫苗抗體水平不同,以及結合比較不同廠家疫苗產生保護性抗體最早時間、維持時間、離散度和最高滴度等指標,制定適合本場的最佳疫苗免疫程序是十分必要的。特別是在使用疫苗尤其是活苗的時候,一定要考慮母源抗體的影響,最可靠和可行的方法就是通過血清學檢測來測定母源抗體的消長,來確定免疫接種的最佳時機。

2.3 確定發病“元兇”,實現疫病凈化 對規模養羊場來說,通過1年左右時間的定期實驗室檢測,基本就能掌握該羊場主要發病的病原種類,那個階段羊群容易發病,然后通過采取免疫、淘汰和檢測三方面結合對該病原實現凈化,如：布魯菌病、小反芻獸疫等疾病。

3 實驗室樣品的采集和送檢工作

3.1 樣品采集前的準備工作

3.1.1 明確采樣目的 要做疫病監測還是疫病診斷,目的不同采樣的方案也會不同。監測以采集正常羊群血樣為主、病料為輔,樣品數量大；診斷以采集發病羊群病料為主。

3.1.2 做好詳細的記錄 畜主姓名和地址、品種、性別、年齡、臨床癥狀、眼觀病變表現(包括大小和位置)、已經采取的措施(如有)、上次治療后復發的時間以及該群動物的發病率/死亡率、相關疫苗免疫情況。如果懷疑為人獸共患病,應在送檢單中明確標注,提醒實驗室檢測人員注意。

3.1.3 采樣物品的準備 器械：包括采樣箱、保溫箱、酒精燈、酒精或者碘酒棉球、各規格的一次性獸用注射器和采血管等,滅菌好的大小解剖取樣器械、各種規格的離心管、玻璃瓶子、平皿、載玻片等,試管架,無菌棉球,膠帶,密封袋和冰袋等。記錄用具：包括記號筆、登記表、標簽紙等,務必和器械類分開放置。樣品保護液：病料保存液(蒸餾水、生理鹽水、30%甘油緩沖液等)、固定液(95%酒精、10%福爾馬林溶液)。防護用品：根據需要應包括：口罩、防護眼睛、膠靴、乳膠手套、連體服、防護帽、消毒液和噴壺、肥皂或者洗手液、手盆等。

3.2 樣品采集操作技術 尿：排尿時,用1次性消毒塑料杯接取20～30 mL。糞：用棉拭子從直腸采集。膿汁、膽汁：用注射器吸取放入滅菌試管中。淋巴結、肺、肝、脾、腎等有典型病變部位采集1～2 cm3的組織塊,置滅菌容器中。血液：羊前腔靜脈采血。無菌采取10 mL,分別置于無抗凝劑和有抗凝劑的采血管中。腸：用線扎緊一段腸道的兩端,然后將兩端切斷,放入滅菌容器中。口瘡、水皰性疾病樣品則采取水皰皮、水皰液放入50%甘油緩沖鹽水中。流產胎兒整個裝入不透水的容器內。

3.3 采樣過程中的注意事項

3.3.1 做好人員防護 采樣人員必須戴好手套、口罩、帽子,穿好工作服等防護用品后,才能進行采樣操作,以減少被感染的機會(炭疽、布魯菌病、口蹄疫等)。死因不明的動物尸體在解剖前應先對病情、病史加以了解、詳細進行檢查,如疑為炭疽(急性死亡、天然孔出血),切不可解剖,經取末梢血液檢查排除炭疽后,方可解剖檢查,并采集病料。

3.3.2 選擇好最佳采樣時機 采集的病料力求新鮮。能進行活體采集的病料盡量進行活體采集,如采集血液、乳汁、尿液以及鼻拭子等。患病動物死亡后,隨著時間的延長,尸體腐敗,組織器官的病理變化會發生一定程度的改變,病原體種類也可能增加,有礙于病原體的檢查。因此內臟病料的采集,須于患病動物死亡后立即進行,一般不超過6 h,夏季最好不要超過4 h,冬季北方可適當延長至24 h。

采集全血液樣品時,被采羊群一般最好先禁食8 h。如果檢測病毒,最好在體溫升高,發病初期采集,對于懷疑帶毒而沒癥狀的動物,最好被隔離7 d以前采樣。在平時做抗體檢測時,應采集兩次,第一次是在理論上抗體最先出現的時期采集,第二次是在理論上抗體快要達到消長的末期時采集。

用作寄生蟲檢測時,要根據被檢測寄生蟲的特點,決定相應的時間和采血的部位,制成血涂片等。

3.3.3 采集有典型性針對性的適量樣品 診斷時一樣本最好發病初期(未用藥),臨床癥狀明顯期采集5只以上病死和發病動物的有病變的器官組織、血清和抗凝血各10份。

免疫效果監測時--動物免疫后14～20 d,隨機采集同群動物血清樣品30份。

3.3.4 病料采集 全過程要求無菌操作,做到一畜一套器械,防止樣品交叉污染。

3.4 樣品的處理 病理組織學檢測樣品：要想使試驗診斷得出正確結果,除采取適當的病料外,需使病料保持或接近新鮮狀態,為此需對病料進行處理。采用10%福爾馬林液(10%甲醛溶液)或95%酒精等固定。固定液體積應為病料的10倍。如用10%福爾馬林固定組織,經24 h必須更換1次新鮮溶液。神經系統組織需使用10%福爾馬林,并且加入5%～10%的碳酸鎂。

細菌學檢測樣品：一般用滅菌的液體石蠟、30%甘油緩沖鹽水或飽和氯化鈉溶液來保存病料。

病毒學檢測樣品：一般使用50%甘油緩沖鹽水,需作組織學檢查的材料最好使用包音氏固定液或岑克氏固定液。

血清學檢驗材料：從發病羊無菌采取血液,注入滅菌試管中,室溫或37℃放置0.5～1 h(有利血清自然分離),然后4℃冷藏[2]。

3.5 樣品送檢 一般采集樣品后必須24 h內送抵實驗室,放在4℃左右的容器中運送。送檢病料的容器一般采用保溫箱或泡沫盒,內置冰塊進行運輸。送檢越快越好,避免病料接觸高溫和陽光,以免病料腐敗或病原體死亡。送檢過程中要防止傾倒、破碎、避免樣品泄漏,要注意有的樣品不能劇烈震蕩,要注意緩沖放置,所有樣品都要貼上能標示采樣羊的詳細標簽[3]。

4 樣品采集過程中的主要事項

4.1 病樣要新鮮 最好采集使用抗生素前的病料,新鮮性且有一定數量,每份樣品單獨分裝好標注好。

4.2 血樣溶血的3種原因 送檢的血樣有溶血現象,可能是以下3種原因造成：(1)消毒采血部位時,酒精未干即行采血,有可能混進酒精造成溶血；(2)血清未分離出,攜帶血液經坐摩托車、拖拉機等劇烈震蕩,使血細胞破裂引起溶血；(3)血液存放的容器不潔。

4.3 病料采集順序 采集病料的順序同解剖檢查的順序,即先胸腔后腹腔、先實質器官后管狀器官。如需要細菌分離檢測,最好是解剖與接樣同時進行,避免外界環境中細菌污染。

4.4 結合實際情況采集 在實際采樣工作中,應結合流行病學特點、臨床癥狀和剖檢變化,大致懷疑是何種疫病,根據該種疫病的特點和需采取的檢查方法不同,采集相關的病料(見表1)。

5 檢測報告分析及注意事項

5.1 分析檢測報告的人必須是最熟悉養殖場的人 熟悉生產中的各個環節,知道免疫程序是什么樣子,知道各個階段羊群免疫效果、發病率、死亡率,現在成為一名合格的獸醫,必須從傳統的治療獸醫或保健獸醫轉變成管理獸醫,拿到檢測報告后結合之前每個季度的檢測報告,馬上就能推算出問題出在哪里,后期可能那些羊群還會出現什么問題?應急措施有哪些?(不能完全依賴檢測機構的建議,除非知道你羊場1年以上詳細的病原和抗體檢測報告,生產環境和管理方式非常了解)。

表1 常見羊病病原檢測推薦采集部位

5.2 關注“離散度” 抗體離散度是指所測的樣品值與所有樣品平均值的距離,距離越大,離散度越大,它是衡量一個羊群檢測值均勻度的一個重要指標,其高低可以反映羊場在免疫后抗體水平的整齊度,為評價規模化羊場整體免疫效果重要指標。以小反芻獸疫為例：群體免疫合格率與抗體離散度成反比關系,群體免疫合格率高,則抗體離散度低；反之,群體免疫合格率低,則抗體離散度高。合格標準：群體的離散度一般≤40%,種畜的離散度要求≤20%,商品畜可以放寬到≤25%。

6 總結

羊場疫病監測不能完全依賴抗體水平監測,必須病原檢測和抗體檢測相結合,因為抗體水平的形成很復雜,有的是打疫苗引起的,有的是自然感染的野毒引起的。我們在分析檢測結果的時候,不能用樣本陽性率去單一分析,需要結合離散度、平均抗體水平、臨床癥狀和生產水平綜合分析。同時在依據實驗室檢測結果制定防控方案之前,一定要與送檢測場獸醫負責人詳細的了解實際情況,這樣實驗室檢測結果才能發揮最大的指導作用。